选修1专题3第3讲

第3讲PCR技术的基本操作和应用

★要点落实

1．PCR的原理

（1）DNA的合成方向：从子链的端向端延伸。

（2）引物的作用：。（3）变性和复性

变性：在的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。

复性：当温度后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。

（4）PCR原理：①DNA半保留复制的原理，使DNA在体外不断扩增；

②DNA的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。（5）TaqDNA聚合酶的特点：。

（6）PCR反应需要的条件：一定的、DNA模板、两种、四种、以及一定的温度和PH。

2．PCR的反应过程：一般要经过三十多次循环，每次循环可分为以下三步：

（1）：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。

（2）：当温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。

（3）：当温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

3．扩增方式：指数扩增= (n为扩增循环的次数)

4．PCR技术的应用：PCR技术有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分

析研究的问题，被广泛应用于遗传病的诊断、、古生物学、

和DNA序列测定等各方面。

5．实验操作中应注意的问题

（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前要进行。（2）缓冲液和酶分装成小份，℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，移液器上的枪头必须。

（4）混匀后要处理，使反应液集中在离心管底部。

【例1】在遗传病刑侦破案中常需要对样品DNA讲行分析，PCR技术能快速扩增DNA 片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：

a链5′—G—G……T—C—3′5′—G—G—OH（引物Ⅰ）

b链3′—C—C……A—G—5′（引物Ⅱ）

95℃

5′—G—G……T—C—3′3′—C—C……A—G—5′

55℃

5′—G—G—OH

5′—G—G……T—C—3′3′—C—C……A—G—5′

72℃

（1）在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。

（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。

（3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为。

（4）PCR反应过程的前提条件是，PCR技术利用了DNA的原理解决了这个问题。

（5）与体内DNA复制相比，PCR反应体系需加入哪两种特别的物质?

___________ ____。

（6）在对样品DNA分析过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要除去这些这些组蛋白可加入的物质是。

【解析】（1）DNA聚合酶不能从开头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a 链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为HO—A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′

（2）经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。

（3）由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含有32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有DNA母链不含32P，，则其所占比例为2/2n•2=1/2n

（4）DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应的碱基一个个地连接起来。只有解旋后，再以母链为模板合成一小段引物，引物才起作用。DNA分子在80℃—100℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。

（6）本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。

【答案】

（1）5′—G—A—OH

HO—A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′3′—C—C……A—G—5′

（2）3′—C—C……A—G—5′5′—G—G……T—C—3′

5′—G—G……T—C—3′3′—C—C……A—G—5′

（3）每个DNA分子各有一条链含32P 1/2n

（4）DNA解旋热变性

（5）两种引物、TaqDNA聚合酶

（6）蛋白酶

★跟踪训练：

PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同：

①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制

A．①②B．①③ C．②④D．③④

★基础训练

一．单向选择题

1．引物的作用是（）

A．打开DNA双链B．催化合成DNA子链

C．使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制D．提供模板

2．DNA在nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关（）

A．220 B．240 C．260 D．280

3．PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是

（）

A．高压灭菌B．用酒精擦洗C．反复洗涤D．在-20℃储存4．PCR技术利用了DNA的原理，来控制DNA的解聚与结合（）

A．特异性B．热变性C．稳定性D．多样性