蛋白质水解度测定方法综述

综述
食品研究与开发
２００７．Ｖｏｌ．２８．ＮＯ．０７ １７５
解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮则 ３．２ 水溶性蛋白质的测定
生成还原型茚三酮。在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、
蛋白质通过酶水解，形成易溶解的小分子的多肽
氨和另一分子茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。
溶液，使得溶解性增加，因此在一定程度上，水解度的
肽键数，这里的 ｈ 和 ｈｔｏｔ 单位经常用 ｍｍｏｌ／ｇ 表示。对于 一个特定的蛋白质，ｈｔｏｔ 是一个常数，一般采用文献中 的经验值，比如：大豆蛋白质的 ｈｔｏｔ 值为 ７．８ ｍｍｏｌ／ｇ，酪 蛋白质的 ｈｔｏｔ 值为 ８．２ ｍｍｏｌ／ｇ，也可以根据蛋白质中氨 基酸的组成成分计算得到［２］。
使用荧光光度计在吸收波长为 ３４０ ｎｍ 条件下测
法，采用本方法测定蛋白质水解度时，不需要经典的 定衍生物的荧光度。水解度的计算公式：
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法那样，对反应体系的 ｐＨ 值进行在线控制，
ＤＨ＝１００ｎ／Ｎ
而只需在水解结束后将反应体系的 ｐＨ 调至 ７．０，并记
式中：ｎ 代表牛乳蛋白水解后肽键的平均数，Ｎ 代
在水解过程中，当肽键断裂后，就会有一个新的 － ＣＯＯＨ 和 － ＮＨ２ 形成，因此，水解肽键的数，就可以根 据水解后测定新形成的末端 － ＣＯＯＨ 或 － ＮＨ２ 基团的 量确定。
２ 水解度测定方法
２．１ ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法主要是基于蛋白质水解过程中，总是
要伴随质子的释放或吸收，质子化的多少，依赖于溶液
原料大豆中游离氨基酸进行测定，计算如下：
４ 小结
ＤＨ＝ 水解蛋白质的７－．８（ＮＨｍ２ｍ含ｏｌ量／ｇ）－ ０．３３（ｍｍｏｌ／ｇ）×１００ ％
其中：０．３３ 是原料大豆样品中游离氨基含量，可根 据自己样品测定值代入。
但是由于不同氨基酸和水合茚三酮显色不同，对 测量结果有部分偏差，例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三 酮反应产生黄色物质，因其 α－ 氨基被取代，所以产生 不同的衍生物。郭兴凤［１３］利用待水解原料的完全水解 液作为标准， 消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产
计算如下：ＤＨ＝
１
Ａ ０００×Ｗ
×Ｖ１×１Ｖ０２０
×１００
式中：Ａ：查表得蛋白质的毫克数；Ｗ：称样重（ｇ）； Ｖ１：水解液的总体积（ｍＬ）；Ｖ２：显色时所用稀释液的体 积（ｍＬ）。 ２．５ 甲醛滴定法
［２］ Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［Ｊ］． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８６ａ Ｌｏｎｄｏｎ
录下所用的碱液的量即可。具体方法如下：水解开始 表每个蛋白分子的肽键总数。ｎ 可用以下公式表示：
时，调节反应体系的 ｐＨ 为 ７．０，反应结束后测定反应 体系的 ｐＨ 值，用 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 将反应体系的 ｐＨ
ｎ＝
ΔＡｂｓ×Ｍ×ｄ ε×Ｃ
调到原来的 ｐＨ，记录下所用的碱液的量，按下式即可 计算出酪蛋白的水解度：
白的分子量，ｄ 指稀释因数，ε 指 ３４０ ｎｍ 处的摩尔消 光系数（６ ０００／ｍｏｌ·ｃｍ），Ｃ 指蛋白浓度（ｇ／Ｌ）。
Ｋａｎｇ Ｓ． Ｌｅｅ 等 利 ［１０］ 用荧光法测定游离氨基酸原 理，针对半胱氨酸与胱氨酸与邻苯二醛反应生成的
１／α 为 ２．２６；Ｍｐ：蛋白质的质量（ｇ）；ｈｔｏｔ：每克原料蛋白 质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取 ８．２ ｍｍｏｌ／ｇ。 ２．２ 三 硝 基 苯 磺 酸 法 （Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ
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２００７．Ｖｏｌ．２８．ＮＯ．０７ １７３
蛋白质水解度测定方法综述
徐英操，刘春红 （东北农业大学理学院应用化学系，黑龙江 哈尔滨 １５００３０）
摘 要：对目前国内外常用的蛋白质水解度测定方法进行了综述，其中 ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 方法是通过滴定水解过程中释放的 质子测定 ＤＨ；ＯＰＡ、ＴＮＢＳ 及国内常用的水合茚三酮和甲醛等测定方法是利用游离氨基的反应测定 ＤＨ。 关键词：蛋白质；水解度；游离氨基；测定
物的呈色度不同对测定结果造成的误差， 并依据 ＱｉｎＹｕｎ Ｃｈｅｎ［１４］的方法和现行的方法进行改进，使测定 结果更接近真实值。
参考文献：
［１］ Ｄｉ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｍ．Ｇ． （１９９７）Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｔｈｌｅｔｅ： Ｔｈｅ ａｎａｂｏｌｉｃ ｅｄｇｅ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
了详细的描述，水解样品的光密度可由下式求得：
３４０ ｎｍ 处有吸收峰的物质。反应是在弱碱性环境中， 在酸性中终止。水解度的计算公式下：
ＤＨ＝
ＡＮ２－ ＡＮ１ Ｎｐｂ
×１００
式中：ＡＮ１ 指蛋白水解前氨基氮的含量［ｍｇ／ｇ（ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ）］；ＡＮ２ 指 蛋 白 水 解 后 氨 基 氮 的 含 量 ［ｍｇ／ｇ（ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ）］；Ｎｐｂ 指蛋白底物中肽键的氮含量。ＡＮ１ 和 ＡＮ２ 的 值可由标样在 ３４０ ｎｍ 时的吸收曲线得知（标样一般采 用 Ｌ－ 亮氨酸）［７］。
一是在研究中需要用其他的方法进行校正；二是这种 成具有荧光性的异吲哚衍生物，其反应如下：
方法仅适用于中性及碱性（ｐＨ＞７）或 ｐＨ＜３ 的酸性溶
液中进行的水解，并且需要特别的仪器控制水解过程
中的 ｐＨ。
袁斌等人［５］在基于国外通用的 ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法基础上，
介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方
根据水解度的定义如果直接用水解后游离氨基总 增加及可溶性蛋白的含量也可以用来表征蛋白质水解
含量计算水解度，由于用水合茚三酮显色法无法判断 的程度。测定水溶性蛋白质的方法很多，有福林 － 酚
水解后的游离氨基是原样品中本来就含有的还是经水 法、双缩脲法、考马斯亮蓝等。
解产生的，因此，赵新淮，冯志彪［１２］对此进行研究，并对
的 ｐＨ，通过加入的用于维持体系 ｐＨ 的碱或酸的量直
接计算出水解度［３］。计算公式如下：
ＤＨ＝
ｈ ｈｔｏｔ
×１００
％＝Ｂ×Ｎｂ
１ ａ
×Ｍ１ｐ
１ ｈｔｏｔ
×１００ ％
式 中 ：Ｂ： 是 碱 液 的 体 积 ｍＬ；Ｎｂ 是 碱 液 的 浓 度
ｍｏｌ／ｍＬ；α：是氨基的离解度；Ｍｐ 是底物中蛋白质总含
量 ｇ；ｈｔｏｔ 是底物中蛋白质中肽键的总数 ｍｍｏｌ／ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ）。
Ｙ．Ｌ． Ｘｉｏｎｇ 等［８］引用 Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ ＴＮＢＳ 法测定了 酶水解 ＷＰ（Ｉ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｅ）的水解度，计算如下：
ｍ（０ ａ０－ ａ）＋ｍ１ａ＋ｍ２ａ＝Ｄｘ 其中：α０ 为底物的初始浓度，α 为每个水解产物 的浓度，ｍ０ 为光密度对底物浓度的直线关系的斜率， ｍ１ 和 ｍ２ 为两种水解产物的斜率。Ｄｘ 任一水解样品的 光密度。 水解度可由下列方程求得： ＤＨ＝κ（Ｄｘ－ ＤＯ） κ等同于 １００（／ α（０ ｍ１＋ｍ２－ ｍ０）），Ｄ０ 初始底物浓度 的光密度。 水合茚三酮与 α－ 氨基酸一起在水溶液中加热， 可发生反应生成蓝紫色物质。首先是氨基酸被氧化分
蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成，在 这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成，称为非必 需氨基酸；而另外约有八种源自文库基酸必需由食物供给， 称为必需氨基酸。食物中如含有全部的必需氨基酸， 而且数量又多，这种食物蛋白质营养价值就高。但是， 存在一个问题，就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于 人体的吸收，因此国内外通过对此进行大量的研究表 明：蛋白质通过水解，水解为二肽或三肽的产物在人 体内要比自由氨基酸易于吸收，比没有水解的蛋白质 更易于吸收［１］。因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进 行水解时，必须要对水解度进行测定。
ｂ１）
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法的优点在于操作简单、快速、可重复
２．３ 邻苯二甲醛（Ｏｒｔｈｏ－ ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ，ＯＰＡ）法 Ｃｈｕｒｃｈ 等［９］人首先于 １９８３ 年应用 ＯＰＡ 测定了蛋
性高，通常被用于水解度的连续测定。然而这种方法 白质水解度，ＯＰＡ 是在碱性介质中与游离氨基反应生
式中：ΔＡｂｓ 指被测样品在 ３４０ ｎｍ 处的吸收峰与 未水解样品在 ３４０ ｎｍ 处吸收峰的差值，Ｍ 指被测蛋
ＤＨ＝Ｂ×Ｍｂ×１ａ ×Ｍ１ｐ ×ｈ１ｔｏｔ ×１００ 式 中 ： Ｂ：ＮａＯＨ 的 体 积 （ｍＬ）；Ｍｂ：ＮａＯＨ 的 浓 度 （ｍｏｌ／Ｌ）；在 ｐＨ７．０，５０ ℃的实验条件下，对于酪蛋白，
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α－ 氨基的解离度可以用下面的公式计算：
１ ａ
＝１＋１０ ｐＫ－ ｐＨ
因为蛋白中亮氨酸游离的氨基的量与碱液的量成
正比关系，斜率用 ｂ 表示，那么分别在 ｐＨ１ 和 ｐＨ２ 下进 行水解，就可以利用下面的公式计算 ｐＫ 值［４］：
ＤＨ＝
ｈｓ－ ｈｔ－
１ 水解度的定义
蛋白质的水解度 ＤＨ（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）代表蛋
白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，数学
表达式为：
ＤＨ＝
ｈ ｈｔｏｔ
×１００ ％
式中：ｈ 是被裂解的肽键数，ｈｔｏｔ 是原蛋白质中的总
作者简介：徐英操（１９７８－ ），男（汉），助教，研究方向：食品蛋白质及酶 水解。
ｈｏ ｈｏ
×１００
式中：ｈｓ 和 ｈｏ 分别代表 ＷＰＩ 水解产物中和没进行
水解的 ＷＰＩ 中氨基酸浓度；ｈｔ 代表用 ６ ｍｏｌ／Ｌ 盐酸完全
水解 ＷＰＩ 产物中总的氨基酸的浓度。没有酶的没水解
的蛋白质溶液视为 ０ ％ＤＨ。
ｐＫ＝ｐＨ２＋ｌｏｇ（ｂ２－
ｂ１）－
ｌｏｇ（１０
ｐＨ － ２
ｐＨ１×ｂ２－
ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＧＲＥＥ ＯＦ ＨＹＤＲＯＬＹＳＩＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥＳ ＸＵ Ｙｉｎｇ－ ｃａｏ， ＬＩＵ Ｃｈｕｎ－ ｈｏｎｇ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｓ ａ ｓｕｍｍａｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆｏｒｅｉｇｎ ｕｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｐＨ－ ｓｔａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ＤＨ （ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙ－ ｓｉｓ） ｂｙ ｐｒｏｔｏｎｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ； ＯＰＡ， ＴＮＢＳ ａｎｄ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ， ｓｕｃｈ ａｓ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ａｎｄ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ａｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅ－ ａｍｉｄｏ’ｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ； ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ； ｆｒｅｅ ａｍｉｄｏｇｅｎ； ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
衍生物具有低荧光性的缺陷，进行研究，建立了通 用、高灵敏度的利用 ＯＰＡ／２－ ＭＥ 进行蛋白质微量氨 基酸分析。
ＴＮＢＳ） 这个方法由 Ｊｅｎｓ Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ［６］于 １９７９ 年进行了
详 细 描 述 ，ＴＮＢＳ 能 与 游 离 的 氨 基 酸 反 应 生 成 能 在
２．４ 水合茚三酮（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）法 早在 １９４９ 年 Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｂ．Ｓｃｈｗａｒｔ ｚ［１１］就已经对此做
在以上的方法中，ｐＨ－ ｓｔａｔ 方法是通过滴定水解过 程中释放的质子测定 ＤＨ，ＯＰＡ、ＴＮＢＳ、水合茚三酮测 定方法及甲醛滴定法都是利用游离氨基发生化学反应 进行测量的，其中用 ＯＰＡ 和 ＴＮＢＳ 测定 ＤＨ 会有很高 的相关性，更精确些，但时间较长。水合茚三酮法测定 的 ＤＨ 一般都很低［１５］。ＯＰＡ 法优于 ＴＮＢＳ，因为更快速 更精确。在用游离氨基显色反应进行测定时，必须要考 虑到，水解后测定的游离氨基含量包括水解释放的游 离氨基和水解前本来就含有的游离氨基。