半夏蛋白质提取方法的研究

质的最佳提取方法。 3. 3. 1 在 确 定 半 夏 蛋 白 提 取 液 的 最 佳 pH 值 之 前，以氢氧化钠调整 Tris 提取液的 pH 值分别为 12、 14，其它条件为： Tris 提取液浓度为 0. 1 mol / L、温度 40 ℃ 、时间 90 min、取样量 0. 1 g，比较浸提效果。 结果 pH 值 12 时半夏蛋白质得率为 187. 1 mg / g，pH 值 14 时得率为 175. 3 mg / g，均较 pH 值 10 时的得 率低。进一步说明半夏蛋白提取液的最佳 pH 值为 10。 3. 3. 2 鉴于正交试验中提取液温度与蛋白质得率 呈正相关，需进一步寻找最佳浸提温度。其他条件： Tris 提取液浓度 0. 1 mol / L，pH 值 10，时间 90 min， 取样量 0. 1 g。结果见表 5。结果表明，半夏蛋白质 的最佳浸提温度为 60 ℃ 。这也说明如果只是在常 温下提取蛋白质是很难达到理想效果的。
表 5 不同温度下半夏蛋白质的提取得率比较（ n =3）
温度 /℃
40
50
60
70
80
得率 / （ mg / g） 198. 6 202. 2 209. 6 203. 5 201. 7
关于 Tris-HCl 缓冲液的浓度，经过实验比较，结 果在 0. 05 ～ 1. 0 mol / L 之间蛋白质得率差别不大。 考虑到节约试剂、减小误差，又便于蛋白质的分离纯 化等后续处理，故将半夏蛋白提取用 Tris 缓冲液的 浓度确定为 0. 1 mol / L。 3. 4 测定实例 半夏供试品（ 生半夏） ，湖北来凤 县栽培，分别为： 自主繁育半夏新品 Y 系（ 样 1） ，来 凤县地方品种（ 样 2） ，以及引种的优良品种鄂半夏 一号（ 样 3） 、湖北传统品种荆半夏（ 样 4） 、云南昭通 市地方品种（ 样 5） 等。按上述方法测定蛋白质含 量，结果见表 6。
2. 1 半夏 蛋 白 质 的 含 量 （ 得 率，mg / g） 测 定 方 法 （ 紫外吸收法〔2，3〕） 取供试品适量，精密称定，加入
发油等。其中半夏蛋白质具有多种生物活性，如抗 生育、抗肿瘤、杀虫等〔1〕等作用。因此，蛋白质含量
提取液在适当条件下研磨提取，置 25 mL 容量瓶中 定容，4 000 r / min 离心 20 min，吸取上清液 10 mL
时，发现其中蛋白质含量较高，约在 20% 左右。虽 果。蛋白质含量计算公式： 蛋白质（ mg / g） = （ 1. 45
然中药材的蛋白质含量测定方法有多种〔5〕，但对同 一种药材，结果不应有如此大的差别，问题可能出在
A280 － 0. 74 A260 ） × 稀释倍数 ÷ 取样量。 2. 2 半夏蛋白质的提取方法 以蛋白质含量（ 得
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半夏蛋白质提取方法的研究
杨红兵，石 磊 （ 湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430061）
摘要 目的： 研究半夏蛋白质的提取方法。方法： 采用正交试验法以及单因素试验法，考察不同条件下半夏蛋 白质的提得率。结果： 半夏蛋白质提取的最佳条件为： Tris 缓冲液 pH 值 10，提取温度 60 ℃ ，时间 90 min，取样量 0. 1 g。结论： 本研究可为半夏质量评价与良种选育提供实验依据，并有助于半夏蛋白质的功能及生产等研究。
机，长沙平凡仪器仪表有限公司； DK-98-1 型电热恒 碱提法，盐提法最低。故选用 Tris-HCl 缓冲液提取
温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。
蛋白法进行正交试验。
表1
文献法提取半夏蛋白质的效果比较（ n =3）
提取方法 碱提法 盐提法 Tris-HCl 缓冲液提取法
提取条件 1% NaOH 溶液，固液比大于 1∶ 15，浸提 60 min，温度 80 ℃ 1. 5% NaCl 溶液，固液比大于 1∶ 15，浸提 60 min，温度 50 ℃ pH 8. 3，固液比大于 1∶ 15，浸提 90 min，温度 20 ℃
研究中，笔者对“3. 4 ”项 下 的 5 种 半 夏 （ 生 半 夏） 用氨基酸自动分析仪进行了测定，结果分别为 16. 6% （ 样 1） 、11. 9% （ 样 2） 、17. 6% （ 样 3） 、12. 5% （ 样 4） 、12. 2% （ 样 5） 。考虑到氨基酸自动分析仪 的检测范围，以及部分氨基酸也并未检测（ 如羟基 脯氨酸、鸟氨酸、色氨酸等） ，可以认为，这 5 种半夏
R
7. 1
B
1 2 3 1 2 3 1 2 3 148. 2 178. 1 193. 6 45. 4
C
1 2 3 2 3 1 3 1 2 167. 3 175. 9 176. 7 9. 4
D
1 2 3 3 1 2 2 3 1 167. 0 174. 2 178. 6 11. 6
得率 / （ mg / g） 133. 5 179. 2 199. 8 154. 0 173. 1 186. 4 157. 1 182. 0 194. 5
表4
Tris-HCl 缓冲液提蛋白法
正交试验结果方差分析表
方差来源 离均差平均和 自由度 方差 F 值 显著性
B
3191. 36
2 1595. 68 33. 78 *
C
Fra Baidu bibliotek
162. 38
2
81. 14 1. 72
D
204. 70
2 102. 40 2. 17
误差（ e） A
94. 47
2
47. 24
注： F0. 05 （ 2，2） = 19. 00，* P ＜ 0. 05
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样品的蛋白质含量与氨基酸总量是相匹配的，该方 法的测定结果基本能反映真实情况。而在相关文献 中，半夏（ 生半夏） 蛋白质含量与氨基酸总量却相差 甚远，互无关联，进一步说明在蛋白质含量测定的前 处理中可能由于提取液 pH 值、提取温度等条件控 制不当、不规范而存在蛋白质提取不完全的问题。
关键词 半夏； 蛋白质； 提取 中图分类号： R284. 2 文献标识码： A 文章编号： 1001-4454（ 2010） 10-1647-03
半 夏 为 天 南 星 科 植 物 半 夏 Pinellia ternata 2 方法
（ Thunb. ） Breit. 的干燥块茎，属常用中药。半夏含 有多种成分，如蛋白质、氨基酸、生物碱、有机酸、挥
从表 3 与表 4 的结果和分析可知，各因素对半 夏蛋白质得率的影响程度为 B ＞ D ＞ C ＞ A，即 TrisHCl 缓冲液提蛋白法影响得率最明显的因素是提取 液 pH 值，其次是提取温度和时间，而取样量的影响 最小。综合各因素以及现代含量测定的微量、快速 原则，Tris-HCl 缓冲液法提取半夏蛋白的最佳条件 为 B3 D3 C2 A1 ，即取样量 0. 1 g，pH 值 10，40 ℃ 条件 下研磨浸提 90 min。 3. 3 针对影响蛋白质得率的重要因素，如提取液 pH 值、提取温度等进行比较试验，以确定半夏蛋白
可作为衡量半夏品质的指标之一。在已有的文献报 （ 可依吸光度大小进行调整，如 5 mL、2 mL 等） ，置
道中，半夏（ 生半夏） 蛋白质含量约在 1% ～ 7% 之 25 mL 容量瓶中定容； 提取液作空白对照； 分别在
间〔2-4〕。然而，笔者在比较半夏的不同栽培品质量 280 nm 和 260 nm 波长下测定吸光度（ A） ，记录结
测量时的前处理上。为此，本实验对半夏蛋白质的 率） 为评价指标，分别进行单因素试验与正交试验，
提取方法进行了初步研究，现报告如下。 1 材料、试剂与仪器
确定半夏蛋白质的最佳提取方法。 首先，参照有关文献〔6〕，分别采用碱提蛋白法、
1. 1 半夏药材（ 生半夏） 湖北来凤县栽培，引种 盐提蛋白法和 Tris-HCl 缓冲液提蛋白法，比较提取
半夏蛋白含量 / （ mg / g） 167. 3 155. 1 181. 8
收稿日期： 2010-06-22 作者简介： 杨红兵（ 1963-） ，男，副教授，博士，主要从事中药品种、质量及资源开发研究； Tel： 027-63649066，E-mail： yanghb321@ 126. com。
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3. 2 正交试验 选择取样量、提取液 pH 值、提取 时间与温度为 4 个因素，按表 2、3 进行正交试验。 结果见表 3、表 4。
表 2 Tris-HCl 缓冲液提蛋白法测定因素与测定水平
干或烘干（ 50 ～ 60 ℃ ） ； 粉碎，过三号筛，备用（ 以烘 白质得率的关键因素，如提取液 pH 值、提取温度等
干法测定水分，但为简化起见，文中数据并未按干燥 进行比较试验，以确 定 半 夏 蛋 白 质 的 最 佳 提 取 方
品计算） 。
法。
1. 2 试剂 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） 为生化试剂 3 结果
水平
A （ 取样量 /g）
1
0. 1
2
0. 25
3
0. 5
B （ pH 值）
6 8 10
C
D
（ 时间 / min） （ 温度 / ℃ ）
60
10
90
20
120
40
表 3 Tris-HCl 缓冲液提蛋白法正交试验结果
试验号 A
1
1
2
1
3
1
4
2
5
2
6
2
7
3
8
3
9
3
Ⅰj
170. 8
Ⅱj
171. 2
Ⅲj
177. 9
表 6 不同样品的半夏蛋白质定量分析结果（ n =3）
供试品编号
样1 样2 样3 样4 样5
蛋白质含量 / % 23. 1 18. 7 23. 6 20. 1 21. 0
4 小结与讨论 本研究经过一系列实验比较，最终确定了半夏
蛋白质含量测定的提取条件为： 取样量 0. 1 g，Tris 缓冲液 pH 值 10，60 ℃ 下 研 磨 浸 提 90 min。其 中 Tris 缓冲液单纯由 Tris 配制而成，浓度 0. 1 mol / L， 实测 pH 值 10. 0 ～ 10. 5。
分含量的影响研究［J］. 中国实验方剂学杂志，2008，14 （ 12） ： 21-23. ［5］ 张善玉，葛娜 . 中药材中蛋白质含量测定方法的研究 ［J］. 中国实用医药，2009，4（ 21） ： 246-247. ［6］ 李淑萍，徐心诚，冯爱华 . 蚂蚁蛋白质提取方法的比较 研究［J］. 信 阳 师 范 学 院 学 报： 自 然 科 学 版，2009，22 （ 4） ： 537-540.
自云南昭 通，经 过 笔 者 鉴 定 为 天 南 星 科 植 物 半 夏 效果。其次，选择取样量、提取液 pH 值、提取时间
Pinellia ternata （ Thunb. ） Breit 的干燥块茎； 10 月末 和湿度为 4 个因素，各自设立 3 种不同的水平，进行
至 11 月初采收； 置水中反复捣搓，去净外皮，取出晒 正交试验，寻找较佳的提取条件。最后，针对影响蛋
［J］. 时珍国医国药，2009，20（ 10） ： 2557-2559. ［2］ 温海霞，张明，蔡家利，等 . 不同叶型半夏蛋白质含量测
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（ BR） ； 盐酸、氢氧化钾等为分析纯； 水为重蒸馏水。 3. 1 采用“2. 2”项下的提取方法，设定取样量 0. 3
1. 3 仪器 752 B 型紫外可见分光光度计，天津市 g，Tris 缓冲液浓度 0. 1 mol / L。结果见表 1。由表 1
普瑞斯仪器有限公司； TDZ4-WS 台式自动平衡离心 可见，Tris-HCl 缓冲液法的蛋白质得率最高，其次是
本实验方法测定半夏蛋白质含量，提取率高，重 现性好，结果可靠，操作简便，费用低廉，特别适合生 产、经营、使 用 等 基 层 单 位 用 于 半 夏 药 材 的 质 量 评 价、良种选育等，值得推广，同时也为其他药材的蛋 白质定量提供了参考。
参考文献
［1］ 徐陶，杜娟，谢丽霞，等 . 半夏蛋白及其基因研究进展