关于高效液相色谱法PPT课件
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关于高效液相色谱法PPT
第十八章 高效液相色谱分析法（ HPLC）
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析 方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键 合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立 的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-12g （荧光检测）
溶剂的选择性
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P' 和组分的k值存在如下 关系：
k2 1 0(P2' P1')/2 k1
式中分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1、k2为组分 相应的容量因子。
例 在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和70%水 (体积比)时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为 0.35min，如何调节溶剂配比使组分容量因子为5？
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相 如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物
分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用
组分的保留和分离 分离选择性决定于键合相的种类、流动相的 强度和试样的性质
极性强的组分k大，后洗脱出柱。
流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小， tR 减小。反之， k增大，tR增大。
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
第一节 高效液相色谱法的主要类型
及其固定相和流动相
一、主要类型
1.固定相的聚集状态
液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC）
2.分离机制：
分配色谱法
吸附色谱法
离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
3.其他色谱类型 亲合色谱法（AC） 胶束色谱法（MC）
手性色谱法（CC） 电色谱法（EC）
1.键合反应 硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 硅氧碳键型： ≡Si—O—C
化学键合相形成具备的条件 1.载体表面应有某种活性基团 2.固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团
2.键合相的种类
（1）非极性键合相 ： 非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 用于反相色谱；ODS
化学键合相色谱法
二、固定相
固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。
(一)化学键合相色谱法（键合相色谱法）
化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法。
化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合 在载体表面所形成的固定相 。
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相和反相键合相色谱法
（一）流动相对分离的影响
R n α-1 k2 4 α 1k2
（二）流动相的强度和选择性
1. 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强
2. 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算
高温（程序升温） 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏
的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒
运行和操作容易
高效液相色谱 可以用于热不稳定物质的分析
室温 没有较高灵敏的通用检测器①
流动相有毒，可供选择范围宽 （梯度洗脱）
运行和操作比GC难一些
特点： 具有分离效率高 选择性好 分析速度快 检测灵敏度高 应用范围广 流动相选择范围宽 柱后流出组分不被破坏，易制备
解：初始值
25.60.35
k1
72.1 0.35
P 1 ' 0 .3 5 0 .1 0 .7 1 0 .2 0 8 .7
5 10(P2' 8.7)/2 72.1
1.16 P2' 8.7 2
6 .3 8 5 .1 (1 )1.2 0 = 0.75
即调整溶剂比例为75%甲醇和25%水可使该组分的k 值为5。
4.键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 柱效高，分离选择性好； 适于梯度洗脱； 载样量大
注意： 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解； (也有适用宽pH范围的键合相)
三、高Baidu Nhomakorabea液相色谱法的流动相
对流动相的要求： 1. 与固定相不发生化学反应。 2. 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 3. 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小 于检测波长的溶剂。 4. 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低 柱压，提高柱效。
（2）极性键合相： 常用-NH2、-CN键合相 （氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶 一般用于正相色谱
（3）离子交换键合相： 常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl
3.键合相的性质 含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基 总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯 硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。
n
Pm' ix iPi' i1
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。
二元混合溶剂的则为
PA ' B APA ' BP
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。I组的xe值较大， 属质子受体溶剂；VII组的xd值较大，属质子给于体溶剂；V组 的xn值较大，属偶极作用力溶剂。同组溶剂在分离中具有相似的 选择性，不同组差别较大。
经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较
经典液相色谱法
常压或减压 填料颗粒大
柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱法
高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m
分析速度快 色谱柱可重复多次使用
能在线检测
气相色谱与高效液相色谱的比较
气相色谱 不能用于热不稳定性物质的分析
第十八章 高效液相色谱分析法（ HPLC）
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析 方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键 合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立 的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-12g （荧光检测）
溶剂的选择性
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P' 和组分的k值存在如下 关系：
k2 1 0(P2' P1')/2 k1
式中分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1、k2为组分 相应的容量因子。
例 在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和70%水 (体积比)时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为 0.35min，如何调节溶剂配比使组分容量因子为5？
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相 如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物
分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用
组分的保留和分离 分离选择性决定于键合相的种类、流动相的 强度和试样的性质
极性强的组分k大，后洗脱出柱。
流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小， tR 减小。反之， k增大，tR增大。
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
第一节 高效液相色谱法的主要类型
及其固定相和流动相
一、主要类型
1.固定相的聚集状态
液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC）
2.分离机制：
分配色谱法
吸附色谱法
离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
3.其他色谱类型 亲合色谱法（AC） 胶束色谱法（MC）
手性色谱法（CC） 电色谱法（EC）
1.键合反应 硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 硅氧碳键型： ≡Si—O—C
化学键合相形成具备的条件 1.载体表面应有某种活性基团 2.固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团
2.键合相的种类
（1）非极性键合相 ： 非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 用于反相色谱；ODS
化学键合相色谱法
二、固定相
固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。
(一)化学键合相色谱法（键合相色谱法）
化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法。
化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合 在载体表面所形成的固定相 。
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相和反相键合相色谱法
（一）流动相对分离的影响
R n α-1 k2 4 α 1k2
（二）流动相的强度和选择性
1. 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强
2. 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算
高温（程序升温） 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏
的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒
运行和操作容易
高效液相色谱 可以用于热不稳定物质的分析
室温 没有较高灵敏的通用检测器①
流动相有毒，可供选择范围宽 （梯度洗脱）
运行和操作比GC难一些
特点： 具有分离效率高 选择性好 分析速度快 检测灵敏度高 应用范围广 流动相选择范围宽 柱后流出组分不被破坏，易制备
解：初始值
25.60.35
k1
72.1 0.35
P 1 ' 0 .3 5 0 .1 0 .7 1 0 .2 0 8 .7
5 10(P2' 8.7)/2 72.1
1.16 P2' 8.7 2
6 .3 8 5 .1 (1 )1.2 0 = 0.75
即调整溶剂比例为75%甲醇和25%水可使该组分的k 值为5。
4.键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 柱效高，分离选择性好； 适于梯度洗脱； 载样量大
注意： 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解； (也有适用宽pH范围的键合相)
三、高Baidu Nhomakorabea液相色谱法的流动相
对流动相的要求： 1. 与固定相不发生化学反应。 2. 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 3. 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小 于检测波长的溶剂。 4. 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低 柱压，提高柱效。
（2）极性键合相： 常用-NH2、-CN键合相 （氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶 一般用于正相色谱
（3）离子交换键合相： 常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl
3.键合相的性质 含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基 总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯 硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。
n
Pm' ix iPi' i1
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。
二元混合溶剂的则为
PA ' B APA ' BP
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。I组的xe值较大， 属质子受体溶剂；VII组的xd值较大，属质子给于体溶剂；V组 的xn值较大，属偶极作用力溶剂。同组溶剂在分离中具有相似的 选择性，不同组差别较大。
经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较
经典液相色谱法
常压或减压 填料颗粒大
柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱法
高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m
分析速度快 色谱柱可重复多次使用
能在线检测
气相色谱与高效液相色谱的比较
气相色谱 不能用于热不稳定性物质的分析