多糖的分离纯化.ppt
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《藻类中多糖的提取》PPT课件
⑴食物纤维主要是指植物细胞壁组成中不能 完全消化的物质。除粗纤维之外，还包括琼 脂质和甘露聚糖层等。
⑵纤维的摄取，由于是低热量，可以防止肥 胖，同时又可使血液中的胆固醇含量恢复正 常，可以抑制大肠癌的发生率，还有防止血 糖升高的功效。
整理课件
6
3、在能源方面的利用
海藻多糖因含有大量的碳原子，经发酵可得 到甲烷、肥料、乙醇和塑料纤维等各种产物。 例如收获的海藻用弱酸处理，使细胞破裂， 碳水化合物和固形物被水解，进而使多糖类 水解。水解后的水溶性糖类经发酵生成乙醇 等。水解后的固形物经嫌气性细菌发酵生成 甲烷。除乙醇、甲烷可作燃料外，还可抽取 分离出作为食品添加剂和医药上重要的褐藻 酸、海藻聚糖、甘露醇和岩藻聚糖等。
整理课件
3
二、多糖的作用
由于经常使用海藻地区的 人们长寿的比较多，
所以它在药理和营养方 面的利用受到人们的重视
1、药理作用 2、营养上的作用 3、在能源方面的利用
整理课件
4
1、药理作用
⑴众所周知，肝素有抗凝血的作用，有降低 血液中的中性脂肪的效果。有人报道认为海 藻中的硫酸多糖、岩藻聚糖、卡拉胶和马尾 藻聚糖也有同样较强而持续的效果。
整理课件
7
三、海藻中多糖的提取工艺
提取过程：破碎、浸提、分离、纯化。
整理课件
8
参考论文
1、海洋微藻多糖提取工艺的研究 2、海带中提取岩藻聚糖的研究 3、小球藻多糖的提取纯化 4、羊栖菜多糖的提取及纯化 5、海藻多糖的分离纯化及组成分析
整理课件
9
1、海洋微藻多糖提取工艺的研究
采用冷冻干燥法 获得藻粉，热水 浸提法从新月藻 和三角褐指藻中 提取，正交试验 获得提取的最佳 工艺：
所以采用循环气升式超声破碎浸提。
⑵纤维的摄取，由于是低热量，可以防止肥 胖，同时又可使血液中的胆固醇含量恢复正 常，可以抑制大肠癌的发生率，还有防止血 糖升高的功效。
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6
3、在能源方面的利用
海藻多糖因含有大量的碳原子，经发酵可得 到甲烷、肥料、乙醇和塑料纤维等各种产物。 例如收获的海藻用弱酸处理，使细胞破裂， 碳水化合物和固形物被水解，进而使多糖类 水解。水解后的水溶性糖类经发酵生成乙醇 等。水解后的固形物经嫌气性细菌发酵生成 甲烷。除乙醇、甲烷可作燃料外，还可抽取 分离出作为食品添加剂和医药上重要的褐藻 酸、海藻聚糖、甘露醇和岩藻聚糖等。
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二、多糖的作用
由于经常使用海藻地区的 人们长寿的比较多，
所以它在药理和营养方 面的利用受到人们的重视
1、药理作用 2、营养上的作用 3、在能源方面的利用
整理课件
4
1、药理作用
⑴众所周知，肝素有抗凝血的作用，有降低 血液中的中性脂肪的效果。有人报道认为海 藻中的硫酸多糖、岩藻聚糖、卡拉胶和马尾 藻聚糖也有同样较强而持续的效果。
整理课件
7
三、海藻中多糖的提取工艺
提取过程：破碎、浸提、分离、纯化。
整理课件
8
参考论文
1、海洋微藻多糖提取工艺的研究 2、海带中提取岩藻聚糖的研究 3、小球藻多糖的提取纯化 4、羊栖菜多糖的提取及纯化 5、海藻多糖的分离纯化及组成分析
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9
1、海洋微藻多糖提取工艺的研究
采用冷冻干燥法 获得藻粉，热水 浸提法从新月藻 和三角褐指藻中 提取，正交试验 获得提取的最佳 工艺：
所以采用循环气升式超声破碎浸提。
香菇多糖提取工艺 ppt课件
超声波提取法 向香菇处理物中加入蒸馏水，进行超声波处理浸提。
8000r/min离心五分钟，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至10~20ml，加入两倍 体积的无水乙醇，进行醇沉。放置过夜后再次离心，留取沉淀物，干燥至恒重。
复合酶浸提法 向香菇处理物的中加 0.1g纤维素酶和0.5g果胶酶,目的是为了酶解细
胞表面结构及细胞间连接物,使其部分糖类物质的溶出。往酶解后的香菇处理物中加入 20 倍体积的蒸馏水,并在40水浴恒温下浸泡80min 。迅速升温沸腾90min ,后过滤得滤液。离 心沉淀,上清液浓缩,乙醇沉淀。
香菇多糖提取工艺
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
香菇多糖提取工艺
thanks for watching
香菇多糖提取工艺
复合酶解,酸与热水相结合浸提法 向香菇处理物中加 0.1g纤维素酶和 0.5g果
胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物, 使其部分糖类物质的溶出。加 20倍体 积的水在 40 水浴恒温下浸泡 80min。后再迅速升温煮沸 60min,用 4层纱布过滤后收集滤 液, 再调节 pH分别为 4.5、5.0、5.5 ,进行酸浸提, 然后再用 4层纱布过滤后收集滤液。合 并两次滤液。浓缩。
热水浸提法 向香菇处理物中加入 20倍体积的蒸馏水,并在 40℃ 水浴恒温下浸泡 4h。
放置冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出, 解冻后在恒温水浴箱内分别抽 提 30min、 60min、90min ,用4层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入20倍体积的蒸馏 水再抽提一次, 沸煮时间同上用 4层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。
8000r/min离心五分钟，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至10~20ml，加入两倍 体积的无水乙醇，进行醇沉。放置过夜后再次离心，留取沉淀物，干燥至恒重。
复合酶浸提法 向香菇处理物的中加 0.1g纤维素酶和0.5g果胶酶,目的是为了酶解细
胞表面结构及细胞间连接物,使其部分糖类物质的溶出。往酶解后的香菇处理物中加入 20 倍体积的蒸馏水,并在40水浴恒温下浸泡80min 。迅速升温沸腾90min ,后过滤得滤液。离 心沉淀,上清液浓缩,乙醇沉淀。
香菇多糖提取工艺
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
香菇多糖提取工艺
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香菇多糖提取工艺
复合酶解,酸与热水相结合浸提法 向香菇处理物中加 0.1g纤维素酶和 0.5g果
胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物, 使其部分糖类物质的溶出。加 20倍体 积的水在 40 水浴恒温下浸泡 80min。后再迅速升温煮沸 60min,用 4层纱布过滤后收集滤 液, 再调节 pH分别为 4.5、5.0、5.5 ,进行酸浸提, 然后再用 4层纱布过滤后收集滤液。合 并两次滤液。浓缩。
热水浸提法 向香菇处理物中加入 20倍体积的蒸馏水,并在 40℃ 水浴恒温下浸泡 4h。
放置冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出, 解冻后在恒温水浴箱内分别抽 提 30min、 60min、90min ,用4层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入20倍体积的蒸馏 水再抽提一次, 沸煮时间同上用 4层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。
分离纯化工艺ppt课件
烷
亲脂性
苷元、生物碱、树脂、醛、酮、 醇、醌、有机酸、某些苷类
乙醚、氯仿
中等极 性
小 中 大
某些苷类（如强心苷等） 某些苷类（如黄酮苷等） 某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）
氯仿：乙醇 （2:1） 乙酸乙酯
正丁醇
亲水性 强亲水性
极性很大的苷、糖类、氨基酸、 丙酮、乙醇、
某些生物碱盐
甲醇
蛋白质、粘液质、果胶、糖类、 氨基酸、无机盐类
•机械分离处理的是两相或两相以上的混合物， 通过机械处理简单地就可将各相加以分离， 不涉及传质过程，例如过滤、沉降、离心分 离、旋风分离和压榨等。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
• 传质分离处理的既可是均相体，也可是非均相体，通过单 个组分的物理-化学特性的差异进行分离，一般是依靠平 衡和速率两种途径来实现。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
（3）温度调节 对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离，一般 在低温条件下进行，大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降 低而降低，可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。 （4）pH值的调节 蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影 响，一般在等电点的溶解度最低。将pH值调节到溶液中多 数蛋白质带有相同的净电荷，可减少蛋白质之间的相互作 用，防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现有选择的分 段沉淀。 （5）离子强度的调节 低浓度的中性盐类增加蛋白质在 有机溶剂中的溶解度，并且对蛋白质具有保护作用，防止 变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需 要更高的溶剂浓度。
《多糖结构解析》课件
质谱技术
通过电离多糖分子并测量其质量 ，可以获得多糖的分子量和组成 信息。
核磁共振技术
通过测量多糖分子中氢原子或其 他原子周围的磁场，可以解析多 糖的精细结构。
生物技术分析法
凝集素结合法
利用凝集素与多糖的特异 性结合，分离纯化多糖， 并进行结构分析。
抗体技术
利用抗体与多糖的特异性 结合，进行多糖的定性和 定量分析。
THANKS
感谢观看
亲和色谱法
利用多糖分子与配体之间的特 异性亲和力，将多糖分离纯化
出来。
分离纯化过程中的注意事项
注意温度和pH值
在提取和分离纯化过程中，要控制好温度和pH值 ，以保证多糖的稳定性和活性。
避免长时间高温
长时间高温会导致多糖的结构发生变化，影响其 生物活性和稳定性。
注意防止污染
在分离纯化过程中，要避免污染，如微生物、杂 质等，以保证多糖的纯度和质量。
03
多糖的结构解析方法
化学分析法
01
02
03
酸水解
在酸的作用下，将多糖水 解成单糖，然后进行衍生 化反应，通过气相色谱或 液相色谱进行分析。
碱水解
在碱的作用下，使多糖水 解成寡糖和单糖，同样需 要进行衍生化反应，再进 行色谱分析。
酶解
利用特异性酶将多糖水解 成特定结构的片段，再进 行分析。
物理分析法
食品工业
食品添加剂
01
多糖可作为增稠剂、稳定剂、口感改善剂等用于食品加工中，
提高食品品质和稳定性。
功能性食品
02
利用多糖的生理活性，开发具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等功
能的食品。
食品包装材料
03
多糖可制成可食用的食品包装材料，具有良好的阻隔性能和环
多糖的分离纯化ppt课件
PPT学习交流
13
将莼菜多糖各组分导入 GPC 软 件，调用标准曲线，得出莼菜多糖 各组分的Mw、Mn 和 D 等，
结果见表 1，莼菜多糖的分子量 分布为 (1. 0507 ～ 1. 5208) × 106 Da，分子量较大。
图 3 显示，高效凝胶渗透色谱 图出峰时间单一，可知莼菜多糖各 组分均一性良好。
10
BSP 精制
BSP 经 DEAE 纤维素 DE52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子量 8 000 ～ 14 000)、浓缩、 冻干各峰组分，得到 BSP1、BSP-2、BSP-3。
取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)，
微量元素， • 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、
茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。
PPT学习交流
5
方法流程
采用碱提醇沉 工艺，经除蛋 白、除色素得 到莼菜多糖 (BSP)
再经DEAE纤 维素DE-52柱 Se p h a r o s e CL-6B琼脂糖 凝胶柱对BSP 进行分级精制
莼菜多糖的分离纯化
汇报人：丁楚蔚
PPT 背景资料：谭晓菁、江淑华
PPT学习交流
1
PPT学习交流
2
目录
PPT学习交流
研究背景 实验步骤与结果 总结与展望
3
1 研究背景
PPT学习交流
4
莼菜
• 睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草， • 有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、
降血脂等功效 ， • 含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及
多糖的研究方法及其进展 PPT课件
糖醛酸 D-葡萄糖酸，D-半乳糖酸，D-甘露糖酸
去氧己糖 L-鼠李糖，L-岩藻糖，6-去氧-塔罗糖
多糖研究与开发的关键
——多糖均一组分
——深入研究结构分析、构效关系 多糖的纯度标准：
不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量 多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种
多糖的相似链长的平均配布
通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：
多糖的研究方法及其进展 PPT课件
血型 ----红血球表面糖链末端糖基的不同
恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同 ----糖链的不同
1995年Hirabayashi提出 “类似于基因密码, 可 能也存在多糖密码”的论点.
多糖的研究己愈来愈受到人们的关注. ——国内外正在形成热点
生物细胞 特征: 繁殖(复制)⇌凋亡 ----平衡
从高等真菌中获得的β-葡聚糖大多具明显 的免疫活性,但它们在消化道内难以被肠道壁 直接吸收而进入血液,所以必须通过注射才能 发挥作用.如果进行结构修饰,使其能被消化道 吸收,变注射为口服,则将大大简化给药途径.
从植物及海藻中获得的活性多糖一般是杂 多糖
-----它们大多口服也有效.
-----植物及海藻来源的活性多糖可以 作为保健品的优越之处
多糖的构效关系的研究是寻找高活性多 糖及深入研究多糖作用机制的基础
最近 作用机理研究 -------进展快
机体 免疫细胞 多糖 ----分子水平
-------激活 --------释放出细胞间传导的信息Cytokine
-------再作用于免疫细胞 ---------体内协同作用
最终 抑制肿瘤生长
表1记录了来自天然界的一些重要多糖。 天然界存在的单糖种类很多,但组成多糖的单糖大致由表
多糖的分离纯化
1.2.2 离子交换层析鹿茸多糖初级分离纯化采用DEAE－52 离子交换柱。
称取鹿茸多糖80mg，溶于10mL 蒸馏水中，4000r /min 离心10min，取上清液样，依次用蒸馏水，0.3、0.5、0.7、1mol /L NaCl 溶液梯度洗脱，流速控制为0.5mL /min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测多糖含量，绘制洗脱曲线，合并同一吸收峰的洗脱液，蒸馏水透析24h，减压浓缩，冷冻干燥，即得DEAE－52 纯化多糖。
1.2.3 凝胶排阻层析鹿茸多糖进一步分离纯化采用Sepharose CL－6B 凝胶排阻层析柱。
将经DEAE－52 分离后的多糖溶于蒸馏水，浓度为10mg /mL，以2mL /次上样，蒸馏水洗脱，流速控制为30mL /h，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，收集、合并相同洗脱组分，透析，冷冻干燥即得SepharoseCL－6B纯化多糖。
1.2.4 鹿茸多糖紫外扫描将Sepharose CL－6B 纯化后精制多糖配成一定浓度溶液，190～400nm 下进行紫外光谱扫描，以蒸馏水作空白。
2.2.4粗多糖的分离纯化2.2.4.1粗多糖的离子柱层析取水提粗多糖样品和碱提水溶性多糖样品溶于蒸馏水中,配制成20mg/mL的溶液,4000印m离心10min,取上清液用DEAE一SepharoseFastFlow离子柱层析(2.6-40cm)进行初步分离,上样量为25mL"首先以蒸馏水洗脱,再用0.1,0.2,0.4,0.6,2mol几的NaCI进行梯度洗脱,自动部分收集仪分步收集流分,洗脱液每10mL收集一管,苯酚硫酸法检测,根据糖显色反应结果合并相同流分"2.2.4.2多糖的凝胶柱层析采用AK认explorer层析系统,Sephaeryl S100一1000凝胶柱层析对样品进行纯化"洗脱条件:凝胶柱Sephacryl S100-1000(2.6X100cm);洗脱液:蒸馏水;流速:1mL/min;样品浓度:10m留mL,上样体积5mL;洗脱液以5mL/管收集,示差折光检测器和苯酚硫酸法检测,以吸光度对洗脱体积作图。
糖的化学提取分离纯化课件
25
• 2.脂多糖革兰阴性菌的细胞壁较复杂含-脂多糖
糖的化学提取分离纯化
26
三.多糖提取分离和纯化的原理
• (一)多糖提取分离
• 第一类难溶于水的提取、第二类易溶于水的提取、
• 第三类粘多糖的提取
• (1)碱液抽提法 (2) 蛋白水解酶消化法
• (二)多糖的纯化 1.分级沉淀法 2.季铵盐络合法
• 5.人工合成多糖。
• 二多糖按其在生物体内的生糖按其组成分类：
• 1.均一多糖 2.不均一多糖 3.粘多糖 4.结合糖
• (1)糖蛋白 1)和含羟基氨基酸以糖苷键以 O 连接
•
2)糖和天冬酰胺的酰胺基以 N 连接 (3) 糖脂
• (2)蛋白聚糖 1)鞘糖脂 2)甘油糖脂
• 3.离子交换层析法 4.制备性区带电泳
• 四多糖理化性质测定。
• (一)多糖的含量测定蒽酮试剂法 620 nm
• (二)多糖的纯度分析紫外扫描法 200 nm
• (三)多糖的分子量测定
• 1.凝胶柱层析法
• 2.特性粘度法
糖的化学提取分离纯化
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五.多糖结构分析的基本原理
物理方法: 红外光谱磁共振光谱质谱 X-射线衍射化学方法化学降解法酶降解法 免疫化学法放射化学法 （一）多糖组成成分分析 1. 酸水解 2. 乙酰解 3.甲醇解。 （二）多糖结构的甲基化分析
•
3)磷酸多糖的萜化学提醇取分糖离纯脂化 4)类固醇糖脂
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二，自然界存在的重要多糖的化学结构与生理功能
• (一)淀粉 (stach)
糖的化学提取分离纯化
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（二）糖原（肝糖）
（四） 和纤维素
（五）琼 胶（agar）
糖的化学提取分离纯化
茶多糖的提取分离PPT课件
利用多糖类物质与其他杂质的分子量差异 ，通过超滤、凝胶色谱等方法将多糖类物 质与杂质分离。
电荷差异
吸附性能差异
利用多糖类物质与其他杂质的电荷差异， 通过离子交换法将多糖类物质与杂质分离 。
利用多糖类物质与其他杂质的吸附性能差 异，通过吸附剂吸附将多糖类物质与杂质 分离。
分离纯化过程
1. 原料准备
选择优质的茶叶原料，进行破碎、 研磨等处理，以便于后续的提取和 分离。
提取原理
热水提取
茶多糖是水溶性化合物，热水可以将 其从茶叶中溶解出来。
酸碱提取
茶多糖在不同的酸碱条件下溶解度不 同，通过调整酸碱度可以促进茶多糖 的溶解和提取。
提取过程
01
02
03
04
茶叶粉碎
将茶叶粉碎成适当大小的颗粒 ，增加茶叶与溶剂的接触面积
，有利于提取。
溶剂浸泡
将茶叶颗粒与溶剂混合，浸泡 一定时间，使茶多糖充分溶解
疾病。
茶多糖具有抗氧化活性， 能够清除自由基，延缓
衰老。
茶多糖能够增强机体免 疫力，提高抗病能力。
02 茶多糖的提取
提取方法
水提法
利用热水从茶叶中提取茶 多糖，是最常用的方法。
酸提法
利用酸性溶液提取茶多糖， 但需要注意控制pH值，避 免影响茶多糖的结构和活 性。
碱提法
利用碱性溶液提取茶多糖， 同样需要注意控制pH值， 避免破坏茶多糖的结构。
农业领域
茶多糖可应用于农业领域，如提高作物抗逆性、增加产量等 。
05 茶多糖的未来展望
茶多糖的深入研究
深入研究茶多糖的结构与功能关系
通过深入研究茶多糖的精细结构，进一步揭示其生物活性与药理作用，为新药研 发提供理论支持。
植物多糖分离纯化方案 ppt课件
粗多糖提取
将所用的植物制品粉碎、过筛、烘干
加20倍体积蒸馏水，60~80℃水浴回流提取4~6 h 离心(5 000×g，10 min)
【取两滴上清液，稀释后加入4 ml 0．1％蒽酮．硫酸溶液，沸水浴7 min，呈 现绿色，说明其中含有糖。再取上清液滴于滤纸上喷0．25％茚三酮试液 ， 加热后立即呈紫红色，说明其中含有蛋白质，需要除蛋白。】
取上清，70°C减压浓缩 加3倍体积95％ 乙醇沉淀，至醇含量在80％以上，不断搅拌
离心收集沉淀，将沉淀置于布氏漏斗中，分别用无水甲醇、丙醇和乙 醚洗涤，以除去水分和杂质
冷冻干燥，得粗多糖
植物多糖的提取
多糖不同的植物中，有着不同的含量和 贮存位置，因此针对不同的植物有着不 同的分离方法。
溶剂提取法
植物多糖分离纯化方案
溶于最小体积水中，用Sevage法，5：1氯仿、正丁醇溶液以3OOO r／min 离心20min脱蛋白
考马斯亮蓝G-250法，重复五次，直至紫外分析无280mm 、260mm 杂蛋白 和核酸吸收峰为止检测至无蛋白质被测出
对流水透析3 d，真空冷冻干燥溶于一定量蒸馏水中，离心(8 000 X g， 5 min)，取上清
在阴离子交换纤维素DE．52柱(4．0 cm x25 cm)上层析。先以多于一个 柱体积的蒸馏水洗脱，再用0～4 mol/L NaCI(250 mL／250mL)线性梯 度洗脱，流速为24 mL/h
• 提取液中加入中性醋酸铅可沉淀去除大部分酸性、酚性的 杂质（如有机酸、氨基酸、蛋白质、树脂酸、黄酮、蒽醌 、鞣质等），包括酸性多糖。而用碱式醋酸铅对多糖的沉 淀就更为完全。除去杂质后的母液用H2S脱盐后，单糖、 低聚糖和水溶性较大的中性苷类仍保留在滤液中。铅盐沉 淀法除去杂质比较完全，母液脱铅后可用于单糖和低聚糖 的定量，也可用铜盐沉淀法提取多糖。
多糖的分离纯化及性质表征PPT课件
一级结构：糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基 的连接方式，异头碳构型一级糖链有无分支，分支的位 置和长短等。
高级结构
二级结构：多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的 有规则的构象
三级结构：以二级结构为基础，由于糖单位羟基、羧 基、氨基以及硫酸基之间之间的非共价相互作用，导致 二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象
2.5脱蛋白
脱蛋白效果的检测方法
1.除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在 280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经 除尽。
2.茚三酮反应检测，结果呈阴性表明蛋白基本除去。
2.6脱色
活性炭脱色
活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特 别适合于水溶性物质的分离。
活性炭脱色效果同活性炭类型、活性炭用量、脱色温 度及pH值等相关。
多糖的纯度鉴定
电泳法（Electrophoresis）
多糖在电场作用下，按其分子大小、形状和所带电荷 的不同而移动不同的距离。若为纯品，电泳后会得单 一斑点。
较常用，目前主要有醋酸纤维薄膜电泳、高压电泳法、 聚丙烯凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳 等
多糖的纯度鉴定
比旋光度测定法
不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同的低级醇 中有不同的溶解度。在一定浓度的低级醇中，分子量 大的较分子量小的溶解度小。因此，不同浓度的低级 醇中得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为 均一组分。
吸附法 干葡聚糖凝胶加入提取液中，两者比例为1:5.由于凝 胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右，多糖回收率 达80%。
2.3多糖提取液浓缩
超滤法
在一定压力下，小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的薄 膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而 使大分子物质得到部分的纯化。
高级结构
二级结构：多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的 有规则的构象
三级结构：以二级结构为基础，由于糖单位羟基、羧 基、氨基以及硫酸基之间之间的非共价相互作用，导致 二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象
2.5脱蛋白
脱蛋白效果的检测方法
1.除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在 280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经 除尽。
2.茚三酮反应检测，结果呈阴性表明蛋白基本除去。
2.6脱色
活性炭脱色
活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特 别适合于水溶性物质的分离。
活性炭脱色效果同活性炭类型、活性炭用量、脱色温 度及pH值等相关。
多糖的纯度鉴定
电泳法（Electrophoresis）
多糖在电场作用下，按其分子大小、形状和所带电荷 的不同而移动不同的距离。若为纯品，电泳后会得单 一斑点。
较常用，目前主要有醋酸纤维薄膜电泳、高压电泳法、 聚丙烯凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳 等
多糖的纯度鉴定
比旋光度测定法
不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同的低级醇 中有不同的溶解度。在一定浓度的低级醇中，分子量 大的较分子量小的溶解度小。因此，不同浓度的低级 醇中得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为 均一组分。
吸附法 干葡聚糖凝胶加入提取液中，两者比例为1:5.由于凝 胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右，多糖回收率 达80%。
2.3多糖提取液浓缩
超滤法
在一定压力下，小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的薄 膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而 使大分子物质得到部分的纯化。
04第四讲 多糖的分离纯化方法
3．浓缩 浓缩操作应在尽量低的温度下进行， 浓缩操作应在尽量低的温度下进行 ， 并尽量防 止提取物与氧气的接触。 止提取物与氧气的接触。 目的：防止多糖被氧化， 目的 ： 防止多糖被氧化 ， 保持多糖原有结构及 生物活性。 生物活性。 (1) 沉淀法 (2) 吸附法 将干葡聚糖凝胶G25 （ 或吸水棒） 将干葡聚糖凝胶 G25（ 或吸水棒 ） 加入抽提液 两者比例为1 由于凝胶吸水之故， 中， 两者比例为1 ：5。 由于凝胶吸水之故， 抽提液 的体积可缩小三倍左右，回收多糖约80% 的体积可缩小三倍左右，回收多糖约80%。 80
新透析袋如不作如上的特殊处理， 新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分 钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。 再用蒸馏水洗净，即可使用。 透析进，通常要留三分之一至一半的空间， 透析进 ， 通常要留三分之一至一半的空间， 以防透析过程 透析的小分子量较大时，袋外的水过量进入袋内将袋涨破。 中 ， 透析的小分子量较大时，袋外的水过量进入袋内将袋涨破。 为了加快透析速度，除多次更换透析液外， 为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子 搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、 搅拌 。 透析的容器要大一些， 可以使用大烧杯、 大量筒和塑料 小量体积溶液的透析， 桶 。 小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒 或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。 或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。
（4）透析法 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23mm-50mm不等。 23mm mm不等 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23mm-50mm不等。 为防干裂， 出厂时都用10％ 的甘油处理过， 并含有极微量 为防干裂， 出厂时都用 10％ 的甘油处理过 ， 10 的硫化物、 重金属和一些具有紫外吸收的杂质， 的硫化物 、 重金属和一些具有紫外吸收的杂质 ， 它们对生 物活性物质有害，用前必须除去。可先用50 乙醇煮沸1 50％ 物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小 时 ， 再 依 次 用 50 ％ 乙 醇 、 0.01 mol/L 碳 酸 氢 钠 和 0.001 EDTA溶液洗涤 最后用蒸馏水冲洗即可使用。 溶液洗涤， mol/L EDTA 溶液洗涤 ， 最后用蒸馏水冲洗即可使用 。 实验 证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。 证明 ， 50 ％ 乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效 。 使用后的透析袋洗净后可存于4 蒸馏水中，若长时间不用， 使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用， 可加少量NaN 以防长菌。 可加少量 NaN2 ， 以防长菌 。 洗净凉干的透析袋弯折时易裂 口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。 用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
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粗多糖的提取
除去脂溶性成分
取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇 2.5 L，60 ℃ 旋转回流提取2 h，过滤， 重复操作 1 次，除去脂溶性成分，滤 渣烘干。
莼菜喷干粉
新鲜莼菜嫩叶，经清 水淋洗、均浆机剪切、 喷雾干燥得莼菜喷干粉 。
莼菜粗多糖
加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 ℃ 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤，滤液 浓缩，加入无水乙醇至 67% ，4 ℃静置过夜， 4 500 r/min 离心 20 min，80% 乙醇洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。
BSP 精制
BSP 经 DEAE 纤维素 DE52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子量 8 000 ～ 14 000)、浓缩、 冻干各峰组分，得到 BSP1、BSP-2、BSP-3。
取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)， 依次用0～1.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用 “2. 2” 项下方法，以洗脱管数 为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。
BSP 精制
洗脱曲线 (图 2) 表明， 莼菜精制多糖 BSP-1、 BSP-3 组分均一，分别 浓缩、冻干 。
对 2 个主要组分 BSP-1、BSP-3 用琼脂糖凝胶柱 Sepharose CL-6B 进一步的分离纯化，用纯化 水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。
分子量测定 色谱条件: 色谱柱 TSK gel G5000PWxl ( 10 )、 G4000PWxl ( 10 )、G3000PWxl (7) (7.
01
03
02
聚酰胺层析
滤液流经预处理的聚酰胺层 析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填 料的体积之比为1∶1，纯化水 洗脱，共收集洗脱液 8 L。
04
得到BSP
获得灰白色胶状莼菜多糖 (BSP) 22 g，收率为 8. 8% 。
BSP含有量测定
01
葡萄糖标准曲线制作
利用蒽酮硫酸法： 以葡萄糖质量浓度为横坐 标 (X)，吸光度为纵坐标 (A)得曲线方程 A = 17. 294X －0. 0076 (Ｒ2 = 0. 9994)。
粗多糖纯化
酶解灭活脱蛋白
粗多糖用 2.5 L 纯化水复溶， 加入木瓜蛋白酶，63 ℃ 酶解 6 h，灭活过滤除去不溶物，滤液 进行第2 次酶解灭活脱蛋白。
滤膜过滤浓缩
再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜 超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇 至67%，4 ℃ 静置过夜后离心， 80% 乙醇洗涤 3 次，减压干燥。
仪器与材料
仪器
Agilent 1200 HPLC 色谱仪 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可见分光 光度计 FD-1C-55 冻干机 旋转蒸发仪 超滤仪 DZG-6020 减压干燥箱
材料
莼菜嫩叶；无水乙醇； NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶； 聚酰胺树脂； DEAE 纤维 素 DE-52；琼脂糖凝胶 Sepharose CL-6B； 透析 袋；蒽酮、硫酸；纯化水
8 mm × 300 mm) 串联; Байду номын сангаас护柱 TSKPWxl Guard column; Agilent 1260 示差折光检测器; 流 动相为纯化水; 体积流量0. 4 mL/min; 进样量 30μL; 柱 温30 ℃ ; 检测器温度 35 ℃ ; 环境温度 25 ℃ 。
称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配 制成2mg/mL的溶液，过 0. 22 μm微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入 GPC软件，建立分 子量分布标准曲线，得到分子量对数 log MW与洗脱体积 VR的线性回归方程 log MW = 10. 513 － 0. 2377VＲ(r = 0. 996 2)，
02
BSP纯度测定
精密称取干燥至恒重的 BSP 24.72 mg 至 500mL 量瓶，纯化水溶解并定容， 摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的 纯度为 61. 89% 。
03
紫外检测
粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋 白、聚酰胺脱色素等处理 后，紫外全波长扫描显示 在 260、280 nm 处其吸 光度接近于零，表明已除 去蛋白质、核酸等杂质。
将莼菜多糖各组分导入 GPC 软 件，调用标准曲线，得出莼菜多糖 各组分的Mw、Mn 和 D 等，
结果见表 1，莼菜多糖的分子量 分布为 (1. 0507 ～ 1. 5208) × 106 Da，分子量较大。
图 3 显示，高效凝胶渗透色谱 图出峰时间单一，可知莼菜多糖各 组分均一性良好。
感谢在座各位聆听
莼菜多糖的分离纯化
目录
研究背景 实验步骤与结果 总结与展望
1 研究背景
方法流程
采用碱提醇沉 工艺，经除蛋 白、除色素得 到莼菜多糖 (BSP)
再经DEAE纤 维素DE-52柱 Se p h a r o s e CL-6B琼脂糖 凝胶柱对BSP 进行分级精制
采用高效凝 胶过滤色谱 (HPGFC)测 定BSP各组 分的分子量