第十六章 转基因技术与作物育种

第十六章转基因技术与作物育种转基因育种：就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA 重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。

与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：

(1)转基因育种技术体系的建立使可利用的基因资源大大拓宽。（没有物种局限性）

(2)转基因育种技术为培育高产、优质、高抗，适应各种不良环境条件的优良品种提供了崭新的育种途径。

(3)利用转基因育种技术可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择：很强的目的性

(4)利用转基因技术可以大大提高选择效率，加快育种进程。

（5）通过转基因的方法，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。

第一节作物的转基因技术

一、转基因技术的发展现状

(一)国际转基因植物研究与现状

1.自从20世纪70年代重组DNA技术创建到1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有35个科120种植物转基因获得成功。（植物）

2.先后有30多个国家批准了3000多例田间试验，涉及的植物种类有40多种，2000年已有13个国家种植了商品化的转基因植物。（国家数量）

3.1996年全世界转基因作物种植面积约为280万hm2，1997年增加到1100万hm2，1998年为2780万hm2，1999年增加到3 990万hm2，2000年达到4420万hm2。（面积增长）

4.1996-2000年，转基因作物大部分(85％)种植在发达国家，其中美国种植的面积最大，2000年为3 030万hm2，占全球的68％。其次为加拿大，2001年为320万hm2。

随着转基因技术的不断完善和普及，发展中国家转基因作物的种植面积也在逐年扩大，所占份额不断增加，从1997年占全球转基因面积的14％，到2000年占到了24％。其中以阿根廷和中国较多。

5.目前所种植的转基因作物主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以转基因大豆的种植面积最大。（不同农作物）

6.目标性状：转基因作物的主要目标集中在培育具有抗除草剂特性的农作物优良品种,其次为培育抗虫和毒病新品种上。

(二)我国转基因作物研究与利用概况

1.我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。

2.主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49项，包括水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种。

4.目前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花(转Bt及Bt+CpTI双价抗虫棉)、美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉，延迟成熟期的转基因番茄，抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄，抗CMV转基因甜椒及转查尔酮合酶(CHS)反义RNA基因矮牵牛。

二、转基因育种的程序

利用转基因技术进行作物育种的基本过程可分为：目的基因或DNA的获得；含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建；受体材料的选择和再生系统的建立；转基因方法的确定和外源基因的转化；转化体的筛选和鉴定；转基因植株的育种利用。

(一)目的基因的获得

目的基因的获得是利用作物转基因育种的第一步。根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物——蛋白进行基因克隆；从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。

1．根据基因表达的产物——蛋白进行基因克隆根据基因表达的产物进行基因克隆的主要步骤如下：首先，分离和纯化控制目的性状的蛋白质或者多肽，并进行氨基酸序列分析；然后，根据所得氨基酸序列推导相应的核苷酸序列；采用化学合成的方式合成该基因；最后，通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。（有很大的局限性）。

2．从基因组DNA或mRNA序列克隆基因随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR 技术的问世及其在基因工程中的广泛应用，已经大大地加快了基因克隆步伐。此外，多种生物基因组序列计划的相继实施和完成，大规模EST数据库的建立，也使得大规模进行基因克隆成为可能。

(1) 同源序列法。同源序列法是根据…。

(2)表达序列标签：表达序列标签主要是通过cDNA的途径获得。利用表达序列标签法进行基因克隆的基本过程为利用已标记的特异探针进行cDNA文库筛选，结合巢式PCR和5'、3'-RACE，得到5'端和3'端部分序列直至获得全长的目的基因。

(3) 根据连锁图谱克隆目的基因。图位克隆

(4) 转座子标签法。

(5)差异显示法。

(二)目的基因重组质粒的构建

(三)受体材料的选择

受体是指用于接受外源DNA的转化材料。能否建立稳定、高效、易于再生的受体系统是植物转基因操作的关键技术之一。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：①高效稳定的再生能力；②受体材料要有较高的遗传稳定性；③具有稳定的外植体来源，即用于转化的受体要易于得到而且可以大量供应；④对筛选剂敏感，即当转化体筛选培养基中筛选剂浓度达到一定值时，能够抑制非转化植株细胞的生长、发育和分化，而转化细胞、植株能正常生长、发育和分化形成完整的植株。

常用的受体材料有以下几大类型。

1．愈伤组织再生系统外植体材料来源广泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且转化效率高的优点；缺点是转化的外源基因遗传稳定性差，容易出现嵌合体。

2．直接分化再生系统此类再生系统的优点是获得再生系统的周期短、操作简单，体细胞变异小，并且能够保持受体材料的遗传稳定性。

3．原生质体再生系统优点是能够直接高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，可以获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，并适用于多种转化系统；缺点是不易制备、再生困难和变异程度高等。

4．胚状体再生系统胚状体作为外源基因转化的受体具有个体数目巨大、同质性好，接受外源基因的能力强，转基因植株嵌合体少，易于培养、再生等优点。

5．生殖细胞受体系统目前主要从两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。

(四)转基因方法的确定和外源基因的转化

概括起来说主要有两类。第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的DNA的直接转化。

1．载体介导转移系统载体法是目前为止最常见的一类转基因方法。

(1)叶盘法。 (2) 真空渗入法。 (3)原生质体共培养法。

2．外源基因直接导入法

(1) 化学刺激法。化学刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA) (2)基因枪轰击法。 (3) 高压电穿孔法。又称为电击法。(4) 微注射法。 (5)其他直接转化方法。如超声波介导法、脉冲电泳法和离子束介导等

(五)转化体的筛选和鉴定

1．转化体的筛选为了有效地选择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择标记基因进行标记。常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因两大类，如卡那霉素抗性基因NP TⅡ和潮霉素抗性基因hpt，除草剂抗性基因bar基因等。

2．转化体的鉴定

(1)DNA水平的鉴定常用的检测方法主要有特异性PCR检测和Southern杂交。

(2)转录水平的鉴定。常用的方法主要有Northern杂交和RT-PCR检测。

(3)翻译水平的鉴定。最主要的方法是Western杂交。

(六)转化体的安全性评价和育种利用

因而，通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种(系)，一般在获得转化体后，应结合利用杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。

第二节转基因作物的遗传特点

1.外源目的基因在许多转化体中都能够稳定整合、正常表达，表现出经典的孟德尔遗传规律。

2.但是，随着转基因应用实践的增多，越来越多的实验发现，外源基因在受体中的命运受到一系列生理生化过程的作用并以复杂的遗传方式表现出来。这主要是由于外源基因进入宿主细胞后，将会受到宿主基因组的监控，一般要发生DNA片段丢失、重排、异常重组，