免疫组化与细胞形态学研究

组织学、细胞学：研究形态结构
组织化学：化学组成含量，酶的存在及活性
第一节 免疫组织化学的定义
一、组织化学（Histochemistry） 组织化学源于组织学、细胞学和生物 化学，又不同于这些学科。
生物化学：破坏细胞，定位性差
组织化学：原位显示，定位性强
第一节 免疫组织化学的定义
二、免疫组织化学（Immunohistochemistry，ICC） 组织化学 免疫组织化学 免 疫 学
二、抗 体（antibody，Ab）
2.抗体的标记： 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不 可见的，若在镜下检测，必须具有可视性标记 物。 标记物：荧光素、酶、铁蛋白、胶体金和放射 性同位素等
2.抗体的标记：
① 荧光素标记： 在抗体上标记荧光素，经特定波长的光照射激 发后能够发出荧光，借此定位观察和追踪。 最常用：异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)，紫外线激发下产生翠绿 色荧光。
2.抗原的两种特性:
①免疫原性 ----能刺激机体产生相应的抗体 ②免疫反应性----可与相应的抗体发生特异性结合
第二节 免疫组织化学中的免疫化学
二、抗 体（antibody ，Ab ）
1.抗体的定义： 是机体在抗原物质刺激下形成的一类能 与抗原特异性地结合的球蛋白，称免疫 球蛋白。
第二节 免疫组织化学中的免疫化学
通过生物化学的方法在原位产生不 溶解的有颜色的反应产物，来显示微细 结构的位置，然后用显微镜观察。
第一节 免疫组织化学的定义
一、组织化学（Histochemistry） 组织化学源于组织学、细胞学和生物 化学，又不同于这些学科。
第一节 免疫组织化学的定义
一、组织化学（Histochemistry） 组织化学源于组织学、细胞学和生物 化学，又不同于这些学科。
* 伊红是酸性染料，粉红色。可以将大多数细胞的细胞质染 成红色。被伊红着色的结构本身为碱性，具有嗜酸性 (Acidophilic)。 * 不易被苏木素和伊红着色的结构具有嗜中性(Neutrophilic)。
肥大细胞的颗粒被甲苯铵蓝(一种蓝色染料)染成紫红色
b. 如果某结构显示的颜色和染料本身的颜色不同，该结 构具有异染性(Metachromasia)。 c. 如果某结构能将银离子还原成银原子，并吸附银原子 而使自身显示棕黑色，该结构具有嗜银性(Argyrophilic)。
生物素：又称维生素H，一种小分子维生素
抗生物素：又称卵白素或亲和素，对生物素具很
强的结合力。 两者即可与抗体偶联，又可被酶标记
生物素---抗生物素系统一端偶联大分子生物
反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底
物，产生颜色反应。
第二节 免疫组织化学中的免疫化学
二、抗 体（antibody，Ab）
A cell-labeling technique called DiOlistics,invented by postdoctoral fellows Wen-Biao Gan, PhD, and Jaime Grutzendler, PhD, and faculty members Rachel O.L. Wong, PhD, and Jeff W. Lichtman, MD, PhD -- distinguishes individual cells in the brain using seven different colors.
–保持标本原有的结构、形态；
–在原位保持待测抗原的免疫活性；
–根据抗原含量及特性选择最佳实验方法。
第三节 组织细胞的处理
一、取材 二、固定 三、脱水 四、透明 五、透入与包埋 六、切片 七、贴片与烤片
第三节 组织细胞的处理
一、取材 免疫组化中常用的组织和细胞标本
• 细胞标本
组织印片 细胞培养片 细胞悬液涂片 石蜡切片
1.甲醛
固定浓度： 固定时间： 固定后处理： 配制方法： 10%水溶液 12-24h 流水冲洗12-24h 甲醛原液10-20ml+蒸馏水90-80ml
特性：渗透力强，组织收缩少。易氧化
（四）常用固定剂的优缺点：
2.乙醇（酒精）
固定浓度： 固定时间： 固定后处理： 配制方法： 80--95%乙醇 取决于组织大小及乙醇浓度4-12h 直接入脱水剂 无水乙醇80-90ml+蒸馏水10-20ml
第一节 免疫组织化学的定义
四、免疫组织化学的优点及应用
组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、
激素、神经递质、受体、表面抗原等均可用免
疫组织化学方法显示，在基础与临床科研中广
泛应用。
第二节
免疫组织化学中的免疫化学
第二节 免疫组织化学中的免疫化学
一、抗 原（antigen，Ag）
1.抗原的定义
能够刺激机体产生免疫反应的物质
（三）理想的固定剂需具备的条件：
1.迅速渗入材料。 2.使细胞不致因固定引起人为的改变。 3.对组织各部分渗透力相等，使组织内外完全固定。
4.尽可能避免组织膨胀或收缩。
5.增加细胞内含物的折光程度和染色能力。
6.使组织变硬，适于切片，但又不至于太硬而松散。
7.固定以后又有保存作用。
（四）常用固定剂的优缺点：
固定时间： 12-24h 固定后处理：70%酒精洗去苦味酸的黄色
（四）常用固定剂的优缺点：
5.Carony液
配制方法： 冰乙酸10ml+氯仿30ml+无水乙醇 60ml
固定时间： 20-40min，较大材料不超过2-4h 固定后处理：直接入脱水剂脱水
（四）常用固定剂的优缺点：
6.戊二醛-多聚甲醛缓冲液
第三节 组织细胞的处理
一、取材 （二）组织标本的取材 1.动物处死的要求： 迅速处死，避免因痛苦产生组织细胞的变形 2.动物处死的方法 麻醉（乙醚、氯仿、4%戊巴比妥、20%氨 基甲酸乙脂） 击头、颈椎脱臼、毁脑和脊髓 股动脉放血、空气栓塞法
第三节 组织细胞的处理
一、取材 （二）组织标本的取材 3. 取材的注意事项 1）处死后立即取材。
配制方法： 4%多聚甲醛磷酸缓冲液中加入0.51%戊二醛
固定后处理：磷酸缓冲液水洗 免疫电镜 应用：
布进行组织和细胞原位检测的技术。
第一节 免疫组织化学的定义 三、免疫组织化学的发展简史
—1941年 Coons 实用免疫荧光技术。
—60年代 Nakane建立酶标抗体技术。 —1981年 Hsu 建立了 ABC 法。 —90年代分子杂交、原位杂交、原位PCR法迅速发展 —2000年各种免疫组化技术更加成熟，成为生命科学 工作者必须掌握的基本技术之一。
特性：兼有硬化和脱水作用。很少单独使用。
（四）常用固定剂的优缺点：
3.A-F液（乙醇-甲醛溶液）
配制方法： 无水乙醇或95%乙醇（A）90ml+ 甲醛原液（F）10ml 固定时间： 组织块4-12h，铺片5-10min 固定后处理：直接入脱水剂脱水
（四）常用固Байду номын сангаас剂的优缺点：
4.Bouin液
配制方法： 饱和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰 乙酸5ml
3. 标记抗体的纯化： 去除抗体溶液中不需要的杂有成分，提高 标记抗体的特异性，减少背景染色。
4.标记抗体的质量评估和保存：
目前我们试验所用的抗体大多由试剂公司
（SIGMA、SANTA等）直接购买
第三节
组织细胞的处理
第三节 组织细胞的处理
•标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
•免疫组化对组织和细胞标本的要求：
免疫组化与 细胞形态学研究
免疫组织细胞化学
（理论10学时、实验30学时）
出勤率 理论30分 笔 记 开卷考试 总成绩 实验表现 实验70分 实验结果 实验报告
10 10 10 100分 20 30 20
参考书：
第一节 免疫组织化学的定义 第二节 免疫组织化学中的免疫化学
主 要 内 容
第三节 组织细胞的处理 第四节 免疫组织化学染色的原理和方法
一、取材 （一）细胞标本的取材
③细胞悬液涂片
海马神经元内11β-HSD1与GR
的免疫细胞化学染色
GC可以促进海马神经元11β -HSD1的表达, 此作用是 否与GR介导的基因机制有关 糖 皮 质 激 素 代 谢 酶 11β - 羟 基 类 固 醇 脱 氢 酶 Ⅰ 型 (11β -HSD1)和糖皮质激素受体(GR)在大鼠海马神经 元内的共同分布及其意义。用免疫细胞化学方法研究 显示, 海马神经元内不仅存在11β -HSD1免疫反应物 质, 还存在GR免疫反应物质, 而且11β -HSD1与GR共 存于同一个海马神经元内
Stylonychia mytilus
AZM、UM、FC
Stylonychia mytilus
Paramecium caudatum
Paramecium caudatum
Stylonychia mytilus
第一节 免疫组织化学的定义
四、免疫组织化学的优点及应用
1.特异性强
优点 2.灵敏度高 3.定位准确
第五节 免疫组织化学技术的实际应用
组织学: 体内结构为立体的，三维的，而课本、讲义和显微镜下 的结构均为平面的，二维的。
石蜡切片
a. 最常用的染料是苏木素(Hematoxylin, H)和伊红(Eosin, E)。 * 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木 素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性(Basophilic)。
2）刀片锋利，维持原形。
3）取材力求小而薄。
4）详细记录材料名称及取材时间。
第三节 组织细胞的处理
二、固 定 （一）固定的目的
1.终止酶的活性，防止自溶。