黄芪提取物免疫调节活性的体外实验研究

*河北省教育厅攻关课题基金(No.2000112)

11河北医科大学基础研究所免疫室(石家庄050017);21河北医科大学第四医院科研中心

#博士之窗#

黄芪提取物免疫调节活性的体外实验研究*

王润田1 单保恩2 李巧霞2 唐建发2 乔 芳2 杜肖娜2 李 宏2 叶 静2

内容提要 目的:研究黄芪提取物(Astragalus mem branaceus extract,AME)对人的外周血免疫细胞(PBIC)免疫功能的调节作用。方法:采用3

H -TdR 掺入法分析AM E 对外周血单个核细胞(PBMC)的增殖活性及对外周血粘附单核细胞(PBAM )吞噬肿瘤细胞的影响;采用51Cr 释放法测定AME 对杀伤性T 细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞的影响;用ELISA 法和生物学法研究AME 对外周血B 细胞(PBBC)产生Ig G 及对PBAM 产生细胞因子的影响;采用SDS -PAGE 分析AM E 的蛋白组成。结果:AM E 能促进PBM C 的增殖;提高CTL 对肿瘤细胞的杀伤活性;增强PBAM 对肿瘤细胞的吞噬和产生细胞因子的功能;促进了PBBC 产生IgG;AM E 含有多种蛋白成分。结论:AME 对人免疫功能有增强作用,提高了抗肿瘤免疫效应,可应用于临床调节免疫功能和治疗肿瘤等疾病。

关键词 黄芪提取物 免疫调节 人外周血免疫细胞 免疫功能

Extracorporeal Experimental Study on Immuno -Modulatory Activity of Astr agalus m emhr anaceus Extract WANG Run -tian,SHAN Bao -en,LI Qiao -xia,et al Dep ar tment of I mm unology ,I nstitute of Basic Medicine,H ebei Medical Univer sity ,Shijiaz huang (050017)

Objective:To study the effect of A stragalus mem br anaceus ex tract (AM E)in regulating the immune function of human peripheral blood immune cells (PBIC)in vitro.Methods:Effects of AME on the proliferation activity of peripheral blood mononuclear cells (PBM C)and the tumor cell phagocytosis of peripheral blood adher -ent monocytes (PBAM )were m easured by using 3H -T dR incorporation.Effect of the tumor -killing activity of cytotox ic T -ly mphocyte (CTL)w as determ ined by using 51 Cr -releasing assay.Effects on production of IgG by peripheral blood B cells (PBBC)and IL -6by PBAM were tested by means of ELISA,and effect on production of TNF -A by PBAM w as studied by means of biolog ical method.Besides,the protein elements of AM E were analysed by SDS -PAGE.Results:AM E could promote the proliferation of human PBM C,elevate the tumor cel-l killing activity of CT L,strengthen the tumor cell phagocy tosis and cytokines (TNF -A and IL -6)production of PBAM ,and promote the IgG production of PBBC.AM E contained multiple protein elements.Conclusion:AM E has effect in enhancing human immuno -function and ant-i tumor activ ity,it could be applied in clinical practice for immuno -modulation and tumor treatment. Key words Astr agalus mem br anaceus extract,immuno -modulation,human peripheral blood immune cells,im muno -function

黄芪为豆科多年生草本植物,主要功效为补气升阳,益气固表,托毒生肌,利水消肿。有报道黄芪有抗肿瘤和增强网状内皮系统吞噬功能的作用(1)

。近年来,对黄芪的研究多集中在强心作用和抗菌作用方面,对其免疫调节机制研究尚不充分。本研究采用人外周

血单个核细胞(PBM C)和粘附的单核细胞(PBAM)体外研究了黄芪提取物(Astragalus mem hranaceus Ex -tract,AM E)对免疫功能的调节活性。

材料和方法

1 药物 AME:1g 黄芪浸泡于100ml 蒸馏水中,过夜后用微火煮沸60m in,待凉后用滤纸过滤,并用一次性针头滤器(Nippon Millipore Ltd,Tokyo )抽滤后放冰箱备用。

2PBMC的分离和增殖反应分析取肝素抗凝血用淋巴细胞分离液分离PBMC。取PBMC(2@105)分别与终浓度为5L g/ml刀豆素A(Con A,EY Labra-tories,San Moteo,CA,USA)、01005%SAC(Staphy-lococcus aureus cow an I,Funakoshi Yakuhin CO. T okyo,Japan)或不同稀释倍数的AME一起,以含10%胎牛血清(FCS)的RPM I1640为培养基,在96孔培养板(No.3072,Falcon Plastics,Ox uard,A)孔内进行培养,一式3个复孔,5%CO2,饱和湿度, 37e(培养条件下同)培养3天(阴性对照孔加PBS)。培养结束前15h各培养孔加入015L Ci(微居里)的3H-胸腺嘧啶(3H-TdR,特异性活性为610Ci/mmol,中国原子能研究所)。用细胞收集器(上海跃进医疗器械厂)将细胞收集,用多功能液体闪烁仪(LS6500,Beck-man counter,USA)测定cpm值(2)。

3CTL活性测定PBM C(2@106)与M itomycin C处理过的成人白血病细胞株MT-2(1@105)在终浓度为1B40稀释的AME(对照加PBS)作用下,37e培养5天,以诱导对MT-2有特异性杀伤活性的CTL。其杀伤活性用放射性铬酸钠(51Cr)释放实验测定(3);将51Cr标记的M T-2(1@104)细胞分别与6125@104、1215@104、25@104上述诱导的杀伤性细胞在012ml 培养液中培养5h,离心培养板,收集每孔之上清液,测定上清液中的放射线活性(cpm)。特异性杀伤活性百分率计算公式:1(试验孔cpm-对照孔cpm)/(最大释放cpm-对照孔cpm)2@100%。最大释放值为51Cr 标记的M T-2细胞与1%Nonidet P-40培养后所得的上清液cpm。

4外周血粘附单核细胞(PBAM)产生T NF-A和IL-6的测定PBMC于培养瓶中培养2h后,弃去非粘附细胞,用刮刀收集贴壁细胞并将其(5@105)与终浓度为5L g/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS, Sigma Chem ical Co.)或终浓度为1B40稀释的AM E,对照加PBS,37e培养2h,上清液中的TNF-A含量用对T NF-A敏感的纤维母细胞株(L929)采用生物学法测定(4)。IL-6含量采用ELISA法测定。

5外周血B细胞(PBBC)IgG的产生和分析PBBC(5@103)与终浓度为01005%SAC或终浓度为1 B40稀释的AM E,对照加PBS,在37e培养7天,收集上清液。用ELISA法(5)测定其中的IgG的含量。

6PBAM对肿瘤细胞吞噬功能的分析按文献(6)方法操作,主要是:如上制备的人外周血贴壁单核细胞(5@105,对照用完全培养基代替)与终浓度为1B 40稀释的AME(对照用PBS代替),37e培养24h,加入肿瘤细胞(X5563细胞5@105,对照用完全培养基代替),37e继续培养48h,培养结束前15h各培养孔加入3H-TdR,收集细胞测定cpm值。

7AM E蛋白成分分析采用SDS-PAGE法(3)分析,蛋白marker用日本产中高分子量(MW: 1414kD-200.0kD)蛋白标准(日本和光纯药工业株式会社,日本大阪)。

8统计学处理数据用

x?s表示。实验组与对照组间采用成组设计两个样本均数比较的t检验。

结果

1AM E对PBMC增殖活性的影响见表1。与PBS比较,AME显著地刺激了PBMC的增殖并有浓度依存性(P<0101)。由于1B40稀释的AM E作用最强,所以在以后的实验中均采用1B40稀释的AME。

2AM E对CT L杀瘤活性的作用见表2。与PBS比较,AM E显著地增强CT L细胞对M T-2肿瘤细胞特异性杀伤活性(P<0101)。

3AM E对PBBC产生IgG的影响见表2。与PBS比较,AME显著地刺激B细胞Ig G的产生(P< 0101),且效力与SAC相当。

4AM E对PBAM产生细胞因子的影响见表3。与PBS比较,AM E显著刺激人外周血粘附单核细胞产生TNF-A和IL-6(P<0101)。

5AM E对PBAM吞噬肿瘤细胞功能的影响见表4。AME单独对人外周血粘附单核细胞的3H-T DR摄取无抑制作用(P>0105),单独对肿瘤细胞的3H-TDR掺入量也无明显抑制作用(P>0105),但却能使其作用的PBAM加肿瘤细胞培养孔的细胞的3H-T DR掺入量显著降低,说明AME显著促进了PBAM 对肿瘤细胞的吞噬。

6AM E的有效成分分析结果见图1。图中右泳道为AME,左泳道为蛋白marker。经SDS-PAGE 分离,AM E显示有多种蛋白组成成分,分子量从1414kD到9714kD之间大小不等。

表1AM E对人PBMC增殖作用的影响(

x?s)组别样本数PBM C的cpm值

PBS3129315?9410

ConA31163210?21717*

SAC31309810?5610*

AM E1B803151610?817*

1B403162111?5016*

1B203147213?4017*注:与PBS组比较,*P<0101