细胞免疫组化

细胞免疫组化

细胞爬片的免疫组化

1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。

2. PBS清洗标本3次各1 min。

3 .冰丙酮固定15 min(或4%多聚甲醛固定30min)。

4. 空气干燥5min。

5. PBS清洗标本3次各2 min。

6. 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20min。

7. PBS清洗标本3次各2 min。

8 .3%H2O2（试剂A）孵育15 min。

9. DPBS清洗标本3次各2 min。

10. 封闭血清孵育（试剂B）20min。

11 .一抗孵育（滴度1：200，湿盒）4℃过夜或37℃60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液

12. PBS清洗标本3次各5 min。

13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37℃30 min。

14 .PBS清洗标本3次各5 min。

15. 试剂D（湿盒）37℃30 min。

16、PBS清洗标本3次各5 min。

17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。

18、蒸馏水洗2次1 min。

19、苏木素复染0.5~1min。

20、自来水洗返蓝。

21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。

22.二甲苯透明2次3min。

23、中性树胶封片。

注意事项：

1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：

a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；

b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、Triton X-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？

1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。

如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。

2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。

细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。

3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。

先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到80％左右比较合适。

偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片

背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。

细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

1. 细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!!

加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为

0.04--0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!

2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!

应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失

3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存

4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。

5. 丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过

夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会

6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。

7. (1)细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟

(2)4%多聚甲醛固定，室温，20分钟

(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好

8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以

放了一个月后去拍,还是很好

9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。

10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达