抗生素类药物的质量分析方法一
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抗生素类药物的质量分析方法 （一）
氨基糖苷类抗生素
概况
抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病 原微生物的药物，按其结构可以分为β-内酰胺 类、四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素。氨 基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而 成的一类多羟基抗生素，是临床上常用的一类 广谱抗生素。可通过微生物发酵或半合成而制 得。目前药典收载的品种主要有：链霉素、卡 那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依 替米星、庆大霉素、新霉素等
结构——庆大霉素
R2
R1HN *
6C‘ R3
5’ O
4‘ 1’ 3’ 2‘
HO
56
O
41
32
O
NH2 *
NH2 * 绛红糖胺
NH2 *
2-脱氧链霉胺
purpurosamine deoxystreptosamine
OH N* HCH3 2“ 3” OH
1” 4“
O 5” CH3
加洛糖胺 garosamine
链霉双糖胺 stroptobiosamine
一、药典方法
中国药典(2000年版)，美国药典(25版)、英国药典 (2000年版)对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微 生物法，有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高 效液相色谱法。微生物法作为一种经典的方法，仍被各 国药典所采用。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩 散作用，采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供 试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供 试品效价。微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响 因素复杂，操作费时 。以下介绍本组同学查阅的其他 方法：
高效毛细管电泳法(HPCE)
HPCE是一类以毛细管为分离通道，以高压直流 电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据 分离模式的不同，又可分为毛细管区带电泳 (CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电 泳(CEC)，胶束电动毛细管色谱(MEKC)等。氨基 糖苷类抗生素的HPCE检测方法，最为常用的是 柱前及柱内衍生的CZE技术，然后进行紫外检测。
二、免疫法(IA)
IA是近年发展起来的一种用于体内药物监测的 分析方法，将分析方法与免疫原理相结合，进 行超微量分析，具有灵敏度高、特异性强、用 样少等优点。
根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫 法(RIA)，酶免疫法(EIA)，荧光免疫法(FIA)， 化学发光免疫法(CLIA)，毛细管电泳免疫分析 法（CEIA)和浊度免疫分析法。
近年来出现的蒸发光散射检测器(ELSD)由于其响应值不 依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样 品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基 本一致，灵敏度是示差折光检测器的2-10倍，现已逐渐 成为目前常用的通用型检测器。在用HPLC-ELSD法测定 硫酸小诺霉素(C2b)注射液时发现有些样品含有庆大霉素 C1a杂质；在分析庆大霉素C组分时发现有的样品在C2与 C2a峰之间有小诺霉素(C2b)杂质峰。由此看出，蒸发光 散射检测器的应用已为全面分析无紫外吸收的氨基糖苷 类抗生素的质量提供了一种新的手段。但本法也有一些 不足之处，例如灵敏度比紫外检测的低(2—3个数量 级)．数据处理相对繁琐。
结构——链霉素
* NH
H2N
NH
HO
3
2
4
1
5
6
C NH
OH NH
* 链霉胍 streptidine
C NH2
O OH
1’ 2‘
O
3’ 4’
6“CH2OH O 5”
O ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱH
1” 4” 2“ 3”
OH
CHO N* H
OH
CH3
链霉糖 streptose
CH3
N-甲基-L-葡萄糖胺 N-methyl-L-glucosamine
薄层色谱法(TLC)
TLC作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素 已被各国药典广泛采用。扫描密度计与TLC技术 相结合产生的高效薄层色谱法(HPTLC)因其灵敏 度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药 物定量分析。 TLC具有使用范围广，样品预处 理简单，优化展开剂的组成方便等优点，随着 吸附剂高效化，定量分析仪器化、自动化，TLC 仍然是不可替代的一种分析方法。
离子交换色谱法（IEC）
采用高效阴离子交换色谱分离硫酸庆大霉素、 硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采 用积分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生， 简便快速。
缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍 显不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重 现性较差
来源：仪器分析网
HPLC—蒸发光散射检测法(HPLC— ELSD)
三、流动注射法(FIA)
流动注射法(FIA)是一种自动分析法，适用于医院制剂的 快速检验及中间体质量控制。 用恒流量泵使硫酸铁铵试剂和载液(水)流过内径为0.5l mm的四氟乙烯泵管，与进样口注量的一定浓度硫酸链霉 素水溶液在反应圈中混合，反应呈包，于520nm处用721 分光光计测A，通过对数转换器，在记录仪上获得相应 的峰高。 硫酸链霉素呈色原理：硫酸链霉素在NaOH中水解成麦芽 酚，与Fe3+呈色，在520nm处有最大吸收峰。
高效液相色谱法(HPLC)
HPLC测定此类药物含量大多采用反相色谱或离子对色谱 系统，根据检测手段的不同可分为紫外检测、荧光检测、 电化学检测及质谱检测等。柱前衍生反相HPLC是此类药 物最为常用的一种测定方法。中国药典采用邻苯二甲醛 (0PA)柱前衍生化，紫外检测硫酸庆大霉素C组份。同时， 有报道用柱后衍生，荧光检测食品中的链霉素残留量。 为了避免使用衍生化试剂，可以采用灵敏度较高的电化 学检测器及采用LC-MS联用技术。LC-MS将HPLC的高分离 效能和质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相 结合，已成为重要的分离分析方法之一。
一、色谱分析法
➢ 气相色谱法(GC) ➢ 高效液相色谱法(HPLC) ➢ 离子交换色谱法（IEC） ➢ 薄层色谱法(TLC) ➢ 高效毛细管电泳法(HPCE)
气相色谱法(GC)
氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光 区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。HoebusL 等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素，用填充柱气 相色谱法，氢火焰离子化检测器检测，在75％一125％的 浓度范围内，呈良好的线性，杂质的定量限为0.1％。 PreuL等选择适当的衍生化试剂，采用毛细管气相色谱。 气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析氨基糖苷类抗生素 也是应用比较广泛的一种联用技术。
氨基糖苷类抗生素
概况
抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病 原微生物的药物，按其结构可以分为β-内酰胺 类、四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素。氨 基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而 成的一类多羟基抗生素，是临床上常用的一类 广谱抗生素。可通过微生物发酵或半合成而制 得。目前药典收载的品种主要有：链霉素、卡 那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依 替米星、庆大霉素、新霉素等
结构——庆大霉素
R2
R1HN *
6C‘ R3
5’ O
4‘ 1’ 3’ 2‘
HO
56
O
41
32
O
NH2 *
NH2 * 绛红糖胺
NH2 *
2-脱氧链霉胺
purpurosamine deoxystreptosamine
OH N* HCH3 2“ 3” OH
1” 4“
O 5” CH3
加洛糖胺 garosamine
链霉双糖胺 stroptobiosamine
一、药典方法
中国药典(2000年版)，美国药典(25版)、英国药典 (2000年版)对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微 生物法，有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高 效液相色谱法。微生物法作为一种经典的方法，仍被各 国药典所采用。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩 散作用，采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供 试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供 试品效价。微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响 因素复杂，操作费时 。以下介绍本组同学查阅的其他 方法：
高效毛细管电泳法(HPCE)
HPCE是一类以毛细管为分离通道，以高压直流 电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据 分离模式的不同，又可分为毛细管区带电泳 (CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电 泳(CEC)，胶束电动毛细管色谱(MEKC)等。氨基 糖苷类抗生素的HPCE检测方法，最为常用的是 柱前及柱内衍生的CZE技术，然后进行紫外检测。
二、免疫法(IA)
IA是近年发展起来的一种用于体内药物监测的 分析方法，将分析方法与免疫原理相结合，进 行超微量分析，具有灵敏度高、特异性强、用 样少等优点。
根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫 法(RIA)，酶免疫法(EIA)，荧光免疫法(FIA)， 化学发光免疫法(CLIA)，毛细管电泳免疫分析 法（CEIA)和浊度免疫分析法。
近年来出现的蒸发光散射检测器(ELSD)由于其响应值不 依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样 品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基 本一致，灵敏度是示差折光检测器的2-10倍，现已逐渐 成为目前常用的通用型检测器。在用HPLC-ELSD法测定 硫酸小诺霉素(C2b)注射液时发现有些样品含有庆大霉素 C1a杂质；在分析庆大霉素C组分时发现有的样品在C2与 C2a峰之间有小诺霉素(C2b)杂质峰。由此看出，蒸发光 散射检测器的应用已为全面分析无紫外吸收的氨基糖苷 类抗生素的质量提供了一种新的手段。但本法也有一些 不足之处，例如灵敏度比紫外检测的低(2—3个数量 级)．数据处理相对繁琐。
结构——链霉素
* NH
H2N
NH
HO
3
2
4
1
5
6
C NH
OH NH
* 链霉胍 streptidine
C NH2
O OH
1’ 2‘
O
3’ 4’
6“CH2OH O 5”
O ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱH
1” 4” 2“ 3”
OH
CHO N* H
OH
CH3
链霉糖 streptose
CH3
N-甲基-L-葡萄糖胺 N-methyl-L-glucosamine
薄层色谱法(TLC)
TLC作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素 已被各国药典广泛采用。扫描密度计与TLC技术 相结合产生的高效薄层色谱法(HPTLC)因其灵敏 度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药 物定量分析。 TLC具有使用范围广，样品预处 理简单，优化展开剂的组成方便等优点，随着 吸附剂高效化，定量分析仪器化、自动化，TLC 仍然是不可替代的一种分析方法。
离子交换色谱法（IEC）
采用高效阴离子交换色谱分离硫酸庆大霉素、 硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采 用积分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生， 简便快速。
缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍 显不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重 现性较差
来源：仪器分析网
HPLC—蒸发光散射检测法(HPLC— ELSD)
三、流动注射法(FIA)
流动注射法(FIA)是一种自动分析法，适用于医院制剂的 快速检验及中间体质量控制。 用恒流量泵使硫酸铁铵试剂和载液(水)流过内径为0.5l mm的四氟乙烯泵管，与进样口注量的一定浓度硫酸链霉 素水溶液在反应圈中混合，反应呈包，于520nm处用721 分光光计测A，通过对数转换器，在记录仪上获得相应 的峰高。 硫酸链霉素呈色原理：硫酸链霉素在NaOH中水解成麦芽 酚，与Fe3+呈色，在520nm处有最大吸收峰。
高效液相色谱法(HPLC)
HPLC测定此类药物含量大多采用反相色谱或离子对色谱 系统，根据检测手段的不同可分为紫外检测、荧光检测、 电化学检测及质谱检测等。柱前衍生反相HPLC是此类药 物最为常用的一种测定方法。中国药典采用邻苯二甲醛 (0PA)柱前衍生化，紫外检测硫酸庆大霉素C组份。同时， 有报道用柱后衍生，荧光检测食品中的链霉素残留量。 为了避免使用衍生化试剂，可以采用灵敏度较高的电化 学检测器及采用LC-MS联用技术。LC-MS将HPLC的高分离 效能和质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相 结合，已成为重要的分离分析方法之一。
一、色谱分析法
➢ 气相色谱法(GC) ➢ 高效液相色谱法(HPLC) ➢ 离子交换色谱法（IEC） ➢ 薄层色谱法(TLC) ➢ 高效毛细管电泳法(HPCE)
气相色谱法(GC)
氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光 区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。HoebusL 等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素，用填充柱气 相色谱法，氢火焰离子化检测器检测，在75％一125％的 浓度范围内，呈良好的线性，杂质的定量限为0.1％。 PreuL等选择适当的衍生化试剂，采用毛细管气相色谱。 气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析氨基糖苷类抗生素 也是应用比较广泛的一种联用技术。