DC细胞治疗癌症进展

309肿瘤医院专家指出，树突状细胞(Dendritic cells，DC)，是最有效的引发原发免疫应答的专职抗原提呈细胞。肿瘤患者的DC具有数量和功能缺陷。正常功能DC?体外培养成功，使其用于临床肿瘤免疫治疗具有可能性，初步的临床实验研究已取得了一定效果。

树突状细胞是专职抗原提呈细胞，在发动原发免疫应答中起关健作用。目前对DC 的了解，尤其是在抗肿瘤免疫等方面的作用已经取得了显著进展。DC包括：朗罕氏细胞、间质树突细胞、并指状树突细胞、隐蔽细胞等，它们广泛分布于除脑以外的全身各个组织器官。人DC缺乏Ｂ细胞、Ｔ细胞、NK细胞及单核巨噬细胞系的特异标志，表达其相对特异性抗原有：CMRF-?44、CMRF-56、CD83等及大量表达MHCI和II 类分子、共刺激分子B7- 1、B7-2、CD40及粘附分子：CD11a、CD11b、CD11c、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-3等。

一、309肿瘤医院专家介绍，树突状细胞功能

现在普遍认为DC是激发Ｂ和Ｔ淋巴细胞介导的免疫反应的重要的高效专职抗原

提呈细胞。DC能活跃地摄取一系列不同的抗原物质，并进行加工和装载到MHCI和II 类分子上。未成熟DC具有很强的内吞能力，这一特性随其成熟而丧失。其摄取抗原的机制有：第一，通过固有巨吞饮作用,?摄取大量液体，然后将大分子溶质加以浓集。第二，通过受体介导的内吞作用，如DC?表达FcγＲ和甘露糖受体，能分别有效地内吞IgＧ免疫复合物和甘露糖化抗原。吞噬作用，是树突状细胞摄取抗原的第三机制。最近的研究表明，体外培养的单核细胞来源的DC能吞噬凋亡小体,但不能摄取坏死物质。

树突状细胞摄取抗原之后，发生成熟，失去内吞能力。但成熟DC具有高效Ｔ细胞（包括纯真Ｔ细胞）刺激能力。其高效Ｔ细胞刺激能力与以下因素有关：特异性高水平表达C－C趋化因子DC-CK1，吸引纯真Ｔ细胞；低水平唾液酸,降低了排斥力，使得其易与Ｔ细胞簇集；大量的粘附分子，使得其易与TCR配接；高水平的共刺激分子，降低了活化阈值，使得激活Ｔ细胞变得更加容易。

树突状细胞能产生IL-12，后者为产生Th-1免疫应答的关键因子。但是，Th细胞应答的性质，不由DC的内在特性决定，而主要受到抗原的生物学活性和/或者微环境因素的影响。外源性IFN-γ促进Th-1细胞应答的发生，而IL－10，PGE2等降低IL－12的水平，促进Th-2细胞应答。

二、309肿瘤医院专家介绍，树突状细胞培养

由于DC在血液中含量稀少，使得其直接从血液中分离受到限制。因此，一些研究小组探索了用细胞因子在体外陪养DC的方法。

Sallusto和Ianzavecchia描述了用GM-CSF，GM-CSF+TNF-α或者

GM-CSF+IL-4培养DC的方法。其中用GM-CSF+IL-4培养的细胞，被证明是刺激能力最强的抗原提呈细胞。

TNF-α培养中的重要性是其抑制粒细胞成熟。另外，TNF-α促进DC成熟，失去加工抗原能力，但活跃地刺激纯真淋巴细胞。IL-4抑制粒细胞和巨噬细胞的产生，保持DC于未成熟状态，加工外来抗原的能力很强。IL-13的性质和IL-4相似。Romani 等描述了从肿瘤化疗骨髓抑制恢复期采集外周血单个核细胞培养大量DC的方法。在这种条件下，获得的造血前体细胞要比稳定状态下获得的单个核细胞数要多。这些细胞，用GM-CSF+IL-4培养，能够产生具有典型表型和功能的DC。Caux等用人脐带血CD34+造血前体细胞，加GM-CSF+TNF-α培养后，5－7天，出现了两类DC前体。第一类：为CD1a+CD14-，成熟为具有表皮郎罕氏细胞的DC，表达Birbeck颗粒，Lag抗原，E-cadherin。第二类，为CD14+CD1a-，成熟为CD1a+DC，具有典型DC的形态和表型以及刺激MLR能力，但是缺乏Birbeck颗粒，Lag抗原。这表明树突状细胞即可由CD34+细胞也可由CD14+单核细胞培养得到。对DC成熟感兴趣的研究小组，正在研究其他细胞因子或物质对DC产生和功能的影响。在人类，添加干细胞因子（kit配体）或flt-3配体到GM-CSF+TNF-α养的脐血CD34+造血前体细胞以后，增加了DC的产量。关于在采集骨髓培养DC之前，体内注射细胞因子的效果研究：最近发现给小鼠体内注射flt-3配体能显著地增加DC的产量。此外，亦有研究表明KRN7000是树突状细胞的激活剂，通过激活树突状细胞而发挥抗肿瘤效应

三、309肿瘤医院专家介绍，树突状细胞用于肿瘤免疫的原因

?肿瘤介导的免疫抑制研究逐渐开始阐明了宿主不能对肿瘤产生有效免疫应答的原因。例如，在动物模型，Huang等发现骨髓来源的专职抗原提呈细胞（相当于DC）是宿主诱导有效的免疫反应的关键。他们的结论表明，肿瘤本身，由于是非专职抗原提呈细胞，不足以激发免疫系统对肿瘤抗原发生应答，理想地，这些抗原应当由DC提呈。

另一方面，一系列研究表明：与正常组织相比，浸润到肿瘤的DC数目要少，如，肺癌、喉癌、鼻咽癌等。最近的报导表明，与正常供体DC相比，从肿瘤分离得到的DC亦具有功能损伤，缺乏抗原提呈功能，大多数不表达B7,导致免疫耐受。

这些研究发现，可以总结如下：1.树突状细胞是引发对肿瘤抗原的强免疫应答的关键。2.肿瘤宿主体内肿瘤浸润DC数量减少和功能受损。由于从肿瘤宿主获取的单个核细胞培养的DC与正常供体培养的DC功能相同。因此，用载有肿瘤抗原的体外培养的自体DC进行免疫以引发肿瘤宿主体内的强免疫应答是一个有希望的策略。

四、树突状细胞抗肿瘤免疫临床前期研究

Hsu等首次用树突状细胞对人类肿瘤进行免疫治疗。四个低度恶性滤泡型B细胞淋巴瘤患者，预先化疗，通过白细胞去除和低密度离心，纯化病人外周血，得到自体DC。将出现在每个病人淋巴瘤中的单克隆表面免疫球蛋白（独特型蛋白）致敏DC。同样,将由Ｔ细胞识别的免疫原性蛋白KLH致敏DC。在1，29，57，150天静脉注射致敏DC。每次注射致敏DC以后，在第14天，皮下注射独特型蛋白和KLH，以加强注射DC后诱导的初发免疫应答。所有病人均产生了抗肿瘤细胞免疫应答。一例患者的肿瘤完全消失，一例部分消退，另一例临床症状完全消除。

Ｓalgaller等载有MHLA-A0201特异性前列腺特异膜抗原（PSMA）的自体DC，治疗激素耐药前列腺癌患者，未见到明显的毒性作用，并增加了细胞免疫应答，降低了PSA水平，在某些患者，还产生了部分临床效果。

五发展趋势

309肿瘤医院专家提醒，树突状细胞对培养条件极其敏感，较小的变化就导致较大的表型和功能差异。因此，用于肿瘤免疫治疗的DC培养最佳条件，可能仍未弄清。这方面，将会得到更深入的研究。有可能多个细胞因子的联用可以较快地生成大量DC。

肿瘤抗原及其装载方面，合成肽段，由于免疫应答的严格MHC限制性，使其临床应用受到限制，肿瘤溶解物，通常不易得到足够数量的碎片，并可能引起对自身抗原的免疫应答，也不适应于临床应用。较吸引人的是基因设计，使?DC表达肿瘤抗原，可望避免MHC限制性问题。而且，还可以基因修饰DC，使其表达细胞因子如：IL-2,IFN-α等，以影响抗肿瘤免疫应答的数量及质量。除此以外，亦可将肿瘤细胞与DC融合，将肿瘤细胞的肿瘤抗原与DC?免疫原能力结合起来。或者将载有肿瘤蛋白抗原的颗粒或基因设计表达一个或多个肿瘤抗原的无害细菌与DC共同孵育等方法，使DC表达肿瘤抗原。但这些方法的有效性，尚待研究。

另外，考虑到体外培养DC和装载抗原的繁琐，亦有提出把DC送到肿瘤部位而不是把肿瘤抗原装载到DC上。甚至可能直接在体内扩增DC,使其发挥抗肿瘤免疫，如用flt-3配体。鉴于肿瘤免疫抑制性环境，这些策略，可能不如体外培养DC并装载抗原有效。

总之，DC用于肿瘤免疫治疗，具有极大前景。亦可望用于儿童血液系统肿瘤及实体瘤的治疗。但还需要对DC的体外培养、肿瘤抗原及其装载和致敏DC回输途径及频次等方面的问题作更加深入的研究。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。（二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

中医治疗小细胞肺癌经验方

小细胞肺癌这种疾病的发生，使人们的生活变得不幸福，中医是治疗小细胞肺癌的常见手段，可全程参与患者的治疗，在抑制病情、改善病症、调理机体、减轻治疗副作用，以及预防复发、转移等多方面都有着不错的作用。随着人们对中医治疗小细胞肺癌效果的认可，中医治疗小细胞肺癌经验方也因此受到一些人的关注。小细胞肺癌，无疑会给患病者的生命健康造成严重威胁，因而一旦确诊需要及时采取治疗。目前小细胞肺癌的治疗提倡多学科、多手段的综合治疗，如手术后联合化疗可杀伤残留微小、转移灶，从而巩固手术疗效，降低术后复发率。除了西医各手段的综合运用外，我国传统医学中医治疗也是小细胞肺癌综合治疗的重要组成部分之一，随着其抗癌功效的日益被认可，在小细胞肺癌综合治疗中也占据着越来越重要的地位。那么，小细胞肺癌患者什么时候介入中医治疗比较好呢？目前，小细胞肺癌的治疗多以西医为主，若此时能够及时介入中医治疗，除了有助于发挥中医本身抗癌作用，增强整体疗效外，而且还有助于调理机体，恢复气血阴阳脏腑功能平衡，有助于机体的恢复。此外，中医治疗在改善手术、放化疗所致的恶心、呕吐、乏力、骨髓抑制等不良反应和损伤方面也有着积极作用，有助于治疗安全、顺利地完成。对于部分患者，如进入康复期患者，中医巩固治疗还能发挥防复发、转移的作用。一些病入晚期患者，在中医保守治疗下也有助于减轻痛苦，提高生活质量。因此，小细胞肺癌患者及时将中医纳入治疗非常重要，但一定要注意避免盲目服用未经专业中医指导的药方，即使是一些经验方，以免因为盲目用药延误治疗时机。由于出身中医世家，百年来家族人习医不辍，更涌现出了一些像袁积德这样能够造福一方百姓，凭医术还被同治、光绪皇帝先后颁发圣旨，诰封为“奉直大夫”的中医。一代代沉淀的中医环境，以及优良家风，让袁希福院长在耳濡目染下对中医学产生了浓厚的兴趣，也立志成为像袁积德等祖辈一样的中医。不错的天赋，加上自身的努力，使袁希福院长得到祖父亲自教导，在其指点下熟读《药性总论》、《本草备要》、《汤头歌诀》等中医名著。北京中医药大学、中国中医研究院的先后学习，多位名家的指点，更让袁希福院长掌握大量理论知识。从医后，袁希福院长仍不断学习，并结合临床积累治疗经验。因此，在从医近四十年的时间里，袁希福院长对于小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗积累下丰富经验，也帮助了很多患者减轻了痛苦，延长了生命。部分参考案例：案例1：左一佩（化名），女，小细胞肺癌，河南新乡人 2015年5月初，左一佩出现反复咳嗽症状，持续了三个多月。在家人的催促下，于2015年8月5日到南阳南石医院检查，8月10日，做完支气管镜后，病理显示：小细胞肺癌，随后左一佩便开始了放化疗。但是化疗和放疗的副作用却让她痛苦不堪，精神不振、浑身乏力，走路时出虚汗，白细胞降低，身体看起来虚弱的很，头发还大片大片地掉。儿子实在是心疼母亲的身体，于是到处打听解决办法，后经人介绍于2015年8月31日到郑州希福中医肿瘤医院求诊。经袁希福院长进行中医中药治疗后，家属反馈：“头一个月效果还不多明显，但是第二个月效果是真的好，身上有劲儿，痰血少了，虚汗也少了，也不发烧。感觉到有效就一直在吃，吃了一年，就感觉特别好了，完全恢复了。”（2016.11.14）报告显示：肺炎，左肺上端片状高密度影；（2017.4.26）报告显示：两肺感染，右上肺高密度影；（2019.10.2）报告显示：两肺炎症，右上肺软组织密度影；

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分：成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒初代消化培养法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。实验步骤一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。二、培养液的更换

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。二.培养细胞生命期（life span of culture cells）很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。三.培养细胞一代生存期培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

植物细胞培养

植物细胞培养一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。二、培养基常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基三、单细胞培养 1、制备方法（1）机械法（机械磨碎、切割）（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法（1）平板法（似微生物平板培养）（2）看护培养与饲养层培养法看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。

（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存（1）继代培养（高等植物、海藻等）（2）低温（ 5℃～10℃）（3）冷冻（ -20℃或液氮）植物细胞冷冻保存方法：在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等）五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性（1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染）（2）培养液流变特性（黏度增高）（3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）

H9c2细胞培养方法

大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述：大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存质量控制：本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。用途：本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作）收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

小细胞肺癌治疗

小细胞肺癌治疗方法小细胞肺癌（SCLC）在肺癌中所占的比例约20~25%，据近年流行病学资料显示该类型已有下降的趋势。SCLC由肺Kulchitsky细胞恶变而来，WHO将其又分为燕麦细胞型、中间细胞型和混合细胞型三种。该病男性多发于女性；发病部位以大支气管（中心型）居多。临床特点为：肿瘤细胞倍增时间短，进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征；由于患者早期即发生血行转移且对放化疗敏感，故小细胞肺癌的治疗应以全身化疗为主，联合放疗和手术为主要治疗手段。综合治疗系治疗小细胞肺癌成功的关键。小细胞肺癌手术治疗通常认为，所有经组织学、细胞学或临床诊断肺癌的患者，只要病期在Ⅱ期以前，且无绝对禁忌症，都可列为手术适应对象。但由于小细胞癌恶性程度高、转移早，一般认为不宜手术治疗。也有人提出，对于早期发现的年青人原发性肺癌，应当采用根治性外科治疗。小细胞肺癌化疗治疗小细胞肺癌的主要方法是化疗，化疗的疗效大多出现在治疗开始后的12周以内，其后很少能看到疗效的进一步增加。一般的说，使用中度强化化疗比常规计量化疗效果要好；但使用大剂量强化治疗并不能进一步提高疗效，反而使更多的病人需要住院治疗。对局限性小细胞肺癌的最佳治疗方案是否应为联合化疗在加胸步放疗，目前还有不同认识。关于化疗-放疗联合治疗方案中的最佳放疗时间问题，目前尚无定论。研究表明，使用对小细胞肺癌有效的化疗药物组成联合化疗方案，所达到的有效率及生存率均优于单药化疗。近年来许多单位使用支气管动脉造影灌注药物化疗治疗小细胞肺癌，普遍报道效果好，副作用较小。小细胞肺癌放射疗法由于单纯用化疗治疗小细胞肺癌的胸腔局部复发率高，所以主张在化疗过程中，辅以胸腔原发灶的放疗，以提高胸内肿瘤的局部控制率。放疗范围：原发灶及已有的淋巴转移灶，并包括较广泛的邻近淋巴引流区；近年来亦有人建议缩小照射范围，仅照射诱导化疗后临床的影像学诊断可发现的肿瘤。小细胞癌中医治疗中药治疗的优势在于扶正祛邪，标本兼治，能够根据肿瘤的形成原因，从根本上抑制消除肿瘤，并提高患者的免疫功能和体质，患者在治疗过程中痛苦

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本

MDCK细胞培养一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。三、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。（二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。（三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。

细胞培养方法

2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备 0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。 2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。

另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细胞ATP是否有影响。所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我们感觉还是最好的方法。细胞培养方法哺乳动物细胞培养规则： 1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。 2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。 3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。 4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。 5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。 6，具体参照https://www.360docs.net/doc/c712887653.html,中细胞培养要求。细胞传代方法 1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。 4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 5，细胞培养液参照https://www.360docs.net/doc/c712887653.html,，一般含有10%胎牛或小牛血清。

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

小细胞肺癌的治疗方法

小细胞肺癌细胞倍增时间短，进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征;由于小细胞肺癌恶性程度高奥，患者早期即发生血行转移，因此治疗上应主要全面有效。小细胞肺癌对于放化疗敏感，因此在患者自身体质尚可的情况下，可采用放化疗进行治疗。当然为了降低放化疗副作用，也可联合中医扶正祛邪进行治疗。对于适合手术的患者可采用手术联合放化疗或者中医治疗的方法进行小细胞肺癌治疗。而对于转移广泛，不易切除，自身体质差的患者可考虑小细胞肺癌中医保守治疗。 1、小细胞肺癌的手术治疗因为小细胞肺癌病情发展快，恶性程度高，多数的患者在确诊的时候已经是中晚期，多数伴有转移。所以，多数患者在发现时已经失去手术的机会。所以小细胞肺癌治疗方法的选择往往摒弃手术。而且，及时适合采用手术治疗的患者，也需联合中医抗癌药物或者放化疗进行巩固治疗，防止手术后复发。而且通过中医抗癌药物的全身性治疗，能很好提高整体的抗癌效果，提高患者的免疫功能，防止癌细胞的扩散转移，改善患者的临床症状，减少并发症发生。 2、小细胞肺癌放疗小细胞肺癌放疗多配合化疗应用，目前多数专家认为在小细胞肺癌化疗中辅助以胸腔原发灶的放疗，可以提高胸内肿瘤的局部控制率。此外，一项meta分析荟萃了7项临床试验共987例化疗后完全

缓解的局限期小细胞肺癌病人进行预防性脑照射，结果显示 3 年生存率增加 5.4%，脑转移发生率从59%下降至33%，这项研究也发现30-36GY 的放疗剂量和化疗完成后6周开始PCI有进一步减少脑转移复发的趋势。

3、小细胞肺癌化疗化疗是小细胞肺癌治疗的重要手段，大约60-90%的局限期小细胞肺癌患者对化疗敏感，而对于广泛期小细胞肺癌的化疗则以联合化疗为主。尽管化疗对小细胞肺癌的近期疗效疗效较好，但化疗的毒副作用较大，患者在接受化疗的时候，会出现不同程度的毒副反应，常有较常见的副作用有食欲减退、恶心、呕吐、口腔溃疡、脱发、白细胞和血小板降低等。而且很多患者常因难以耐受其副作用而使治疗中断，导致治疗失败。大量临床实践和有关研究证实，化疗时配合使用中药参芪十一味颗粒、升血调元汤等可刺激骨髓的造血功能，提高巨噬细胞的数量从而提高机体的免疫力降低毒副作用，增强疗效。 4、小细胞肺癌的中药治疗经临床证实中药治疗小细胞肺癌的疗效显著，可明显患者改善症状延长生存期。中医以“扶正固本”、“标本兼治”为基础，通过“辨证施治”在治疗小细胞肺癌方面取得显著的成就。其中以复方斑蝥胶囊

植物细胞悬浮培养技术

植物细胞悬浮培养技术一、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。二、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子三、操作步骤 1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒（1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。（2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。（3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。（4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始：当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞

实验总结细胞培养方法

一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏步骤： 1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。 3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。 7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基

小细胞肺癌到了晚期是不是发展的很快

小细胞肺癌是肺癌的一种，虽所占比例不高，但是转移早而广泛，对人们身体健康都造成很大的危害。对于小细胞肺癌这种肿瘤疾病，做到早发现、早诊断、早治疗，效果往往比较显著，患者预后也较好，有不少患者认为一旦到了晚期就意味着离死不远了，病情发展很快，那小细胞肺癌到了晚期是不是发展的很快呢？当小细胞肺癌到了晚期时，病情发展速度相对较快，但不同的病理分型有不同的发展速度，一般来说恶性程度较高的患者，在晚期会较快出现扩散转移，而恶性程度较低的患者，发展速度相对较慢。对于小细胞肺癌晚期患者来说，虽然无法明确病情发展的速度，但却可以通过积极、有效的治疗，控制病情发展，抑制肿瘤细胞的生长繁殖，减轻患者痛苦，延长生存时间。对于小细胞肺癌晚期的治疗，手术的机会不大，患者可以选择放化疗和中医治疗，其中中医作为我国的传统医学，发展至今已经有几千年的历史了，在治癌方面积累了丰富有效的经验，已成为治疗小细胞肺癌不可或缺的手段之一，患者应及时配合治疗。中医治疗小细胞肺癌应用广泛，能够联合放化疗进行综合治疗，放化疗虽然能控制病情，抑制扩散转移，但产生的副作用也会损伤机体，影响患者生存质量和生存时间，在放化疗的过程中联合中医药的治疗，有助于减轻放化疗的副作用，增强患者免疫功能，提高机体对放化疗的敏感性，提高整体的治疗效果，预防病情反复，进一步延长生存时间。对于年老体弱、广泛转移，不能或者不愿放化疗的患者，可以采用中医保守治疗。中医治疗通过增强免疫力、体质，维持机体免疫功能与肿瘤对抗的平衡，把阴阳、气血、脏腑调理好，让免疫系统来吞噬癌细胞，达到控制病情，提高生存质量，延长生命的作用。中医治疗遵循整体施治、标本兼治的原则，是治疗小细胞肺癌的重要手段之一，出身中医世家的袁希福在12岁时，就在祖父指导下开始熟读《药性总论》、《本草备要》、《汤头歌诀》等中医名著。为了提高理论水平，袁希福还曾先后到北京中医药大学及中国中医研究院深造，师从多位名家，为从事中医中药治疗恶性肿瘤打下坚实的理论基础。通过长期的研究与总结，袁希福指出小细胞肺癌的病机非常复杂，但主要病机可以简单地概括为三个字“虚、瘀、毒”。他强调:在治疗中仅着眼于局部是不够的，要想达到治疗目的，必须全面调理、重点用药，从而使人体达到自然状态下的阴阳平衡。就这样逐渐形成了他独特的中医抗癌三联平衡理论。 “三联”是指联系到肿瘤患者存在的元气亏虚、痰凝血淤、癌毒结聚三大基本病因病机，用药进行扶正补虚、消痰化淤、攻毒散结；“平衡”是指使患者气血、阴阳平衡。概括地说，就是联系到“虚”“淤”“毒”三大病因，以“扶正”“通淤”“排毒”辨证施治，达到调节人体阴阳、气血生理机能平衡的根本目的。如在郑州希福中医肿瘤医院先后举办的五届百位抗癌明星中医康复经验交流大会上，有部分参会患者在该理论指导用药下减轻了痛苦，延长了生命，甚至一些实现了临床康复或长期带瘤生存。部分参考案例：案例1：赵学而（化名），小细胞肺癌，低分化神经内分泌癌骨转移，脑转移，河南禹州人 2019年1月，赵学而因突然腹痛，到当地县医院检查，被确诊：小细胞肺癌，低分化神经内分泌癌，脑部有三处病灶，并有骨转移。本来老先生想要手术切除，但病属晚期，加上又是小细胞肺癌，不能手术，只能化疗。于是，按医生的建议行化疗后，仅一次化疗，老先生便感受到了巨大的副作用。身体虚弱的他