土壤宏蛋白质组学

Company
Logo
2.2 .获取微生物蛋白 2.2.
� 此外，如果能够清楚地知道某一生 境中微生物的组成，然后再模拟天 然生境，培养微生物，能明显提高 微生物蛋白提取效率。 � Taylor用 DGC-EXT提取蛋白， SDS-PAGE后图像有6~10条带， 加入葡萄糖和甲苯培养后的土壤蛋 白质条带增加至40个。 � 模拟生境先培养后提取的方法也有 局限性，对于某些组成相对简单， 某种或某几种微生物占绝对优势的 样品来说，这一方法是可行的，但 对于这里讨论的宏蛋白质组学来 说，由于人为降低了样本复杂性， 因此对研究结果仅能起到部分补充 作用。
Company
Logo
1.环境微生物样品 2. 2.1.
粗蛋白样品制备
原位收集法
在尽量不破坏土壤原有 结构和状态的情况下收 集土壤溶液，能够较真 实反映土壤溶液的真实 状况；只能收集游离的 、溶解的蛋白质组分， 受土壤含水量限制，往 往收集到的土壤溶液很 少，组分含量也较低
浸出收集法
用各种酸、碱或盐 等溶液讲土壤中可 溶性成分浸提出来 ，不同的提取液、 提取时间、提取 pH均会影响提取 效果
Company
Logo
SDS-PAGE of protein extracted from DGC-isolated microbial cells isolated from toluene-amended Benfield soil (10 g dry weight). (1) Protein from DGC-isolated microbial cells taken from tolueneamended soil, replicate 1. (2) Protein from DGC-isolated microbial cells extracted from tolueneamended soil, replicate 2. (3)Protein from DGC-isolated microbial cells extracted from unamendedsoil; 20 μg total protein loaded per well
Brock (1987) 认为实验室条件下培养的微生物 特性并不能反映其在自然环境下的活性与生理 机能，因为在自然环境下资源竞争、环境不均 等、捕食和其他作用的影响是不可忽略的； 地球上绝大部分微生物 (约99％)是未培养微生 物，即指那些利用分子生物学技术能够检测 到，迄今所采用的微生物纯培养分离、培养方 法还未获得纯培养的微生物。
Company
Logo
� 对特定环境或受环境刺激后产生的蛋白质鉴定完毕后，还需要将这 些蛋白质与相关基因联系起来，这也是元蛋白质组学最终目的之一。 将经过质谱技术所鉴定的蛋白质序列输入数据库进行检索即可获得 目的蛋白的相关信息，但目前蛋白质数据库中的蛋白质大多来源于 已培养微生物，数据库中包含的未培养微生物蛋白质的信息非常 少，这是目前元蛋白质组学研究面临的一个重大问题。
Company
Logo
2.2 .3.胞内蛋白 2.2.
� 细胞内蛋白提取采取的策略一般有直接提取法和先收集细胞再提 取蛋白法（DGC-EXT），后者又称间接提取法 . � 直接提取法是指采用原位或浸出法直接提取出总蛋白，再通过过 膜、沉淀（如苯酚沉淀）、离心（如密度梯度离心）等纯化分离 手段分离出细胞蛋白； � 间接法则指先通过过膜、离心、沉淀等方法将细胞分离出来，再 裂解提取细胞蛋白； � Chourey等提出了一个新的微生物蛋白直接提取法 ——SDSTCA法，即同时采用 SDS、加热两种变性方法，结合 TCA沉淀， 丙酮洗涤等步骤，提取出适合液质联用分析的样品。在不同土壤 样品中均能鉴定出 500个以上的蛋白。与间接法相比，表现出明 显的优势，认为是目前为此最有效的用于土壤微生物蛋白质组学 的提取方法。
Company
Logo
.蛋白质的分离 2.3 2.3.
� 获取蛋白质样品后，即可根据获取信息的不同以及研究程度的不 同，采取不同的方法分离蛋白质，目前主要采用双向电泳和色谱技 术。要通过非标记方法获取微生物群体的 “蛋白质指纹图谱 ”，必须 通过1-D 或者2-D 电泳分离蛋白质。 � 2-D电泳对蛋白质的分离效果较好，而且有利于下一步进行 MS 分 析，以及后续利用 MS 数据与数据库比对进行肽段鉴定；但是这种 技术也有其局限性，例如不能检测低丰度、高疏水性、高酸性和高 碱性蛋白的表达。因此， 2-D 电泳也被称为 “蛋白质组学的薄弱环 节”。 � 在这种背景下，必须有选择地使用各种分离方法。蛋白质组学领域 内已出现了若干新技术，例如色析法/ 毛细管电泳分离法以及蛋白 质微阵列法。应用这些最新方法能够对复杂的蛋白质混合物进行高 通量分析，有利于蛋白质组学在环境微生物研究中发挥作用。
Logo
2.2 .1.总蛋白提取（直接提取法） 2.2.
� 直接提取法提取土壤总蛋白，通常需要原位裂解，以释放更多的 土壤蛋白. 原位裂解能提供样品中细菌、真菌、原生动物等所产 生的全部蛋白混合物， � 但这种混合也会造成分类学上的困难； � 由于干扰物的存在，直接裂解应用到天然环境蛋白提取中仍存在 很大的技术困难 . � “分步提取法 ”（先从土壤样品中提取蛋白质、微生物、腐殖酸等 ，然后再经过一步酚抽提，将蛋白和腐殖酸分开，然后进行蛋白 质组学研究），该方法有利于土壤宏蛋白质组学的功能分析，可 以分别提取细胞内蛋白和胞外蛋白，但是蛋白质得率很低，需要 经过预培养或接种才能获得足够分析的蛋白质含量。
宏蛋白质组学：研究微生物群落新策略
学生：王秀玲 导师：李潮海 教授
2012-12-15 郑州 Company
LOGO
Company
Logo
报告提纲
1 2 3
宏蛋白质组学的产生
宏蛋白质组学的研究策略
宏蛋白质组学的应用
Company
Logo
1.宏蛋白质组学的产生
20世纪60年代，大多数研究依赖于单菌培 养，但是这种方法难以反映微生物及微生 物预期环境之间的相互作用；
Company
Logo
追踪新功能基因和复杂代谢路径
� 宏蛋白质组学可以检测复杂生物途径中的新基因。绝大部分功能 基因编码的酶都可以催化一些简单反应，例如氮循环中的一些反 应，可将这些基因作为遗传标记分析特定微生物群体的结构； � 但是这种方法仅限于少数功能基因，不利于分析复杂生物途径中 繁杂多样的基因，尤其是复杂生物化学循环 ( 例如碳循环) 中涉 及的基因； � 在此，宏蛋白质组学就表现出一定优势，首先通过非标记的方法 鉴定出某些生物化学过程中涉及的蛋白质，然后通过反向遗传学 推测氨基酸序列获得相应的编码基因信息，最终用于开发 DNA/ RNA 探针，将分子生物学、生物化学、目标功能基因以及相关 蛋白结合在一起，追踪复杂环境中相关微生物群体的功能 。
Company
Logo
.蛋白质的鉴定 2.4 2.4.
� 蛋白质的鉴定主要依赖于质谱技术。 � 在蛋白质库中，通过同位素标记可以检测响应某种条件而合成的蛋 白质，可丙烯酰胺凝胶上分离后通过放射自显影技术进行检测，或 者也可以通过免疫学方法来检测，对复杂环境 ( 例如土壤) 中的蛋白 质进行量化。 � 通过蛋白质定量可以窥见微生物群体的功能信息 ( 例如某特定时刻 遗传潜力表达水平 )。但是，这种方法受到不同微生物群体中特定功 能蛋白质(例如异化硝酸还原酶 ) 的抗体标记特异性的限制，同时还 受到少数具有生物催化功能的酶 (氮循环中的酶 ) 影响。特定肽段可 依据其代谢活性，通过环境蛋白质免疫印迹法以及染色法来鉴定。 这种方法要求保持酶的分解代谢能力，即采用温和、非变性蛋白提 取步骤，从而精确地分离出环境中的目的蛋白。
特定环境或共生体 内所有生物遗传物 质的总和，是一种 不依赖于人工培养 的微生物基因组分 析技术。
指环境混合微生 物群落中所有生 物的蛋白质组总 和。宏蛋白质组 学则是针对某一 特定地点的微生 物群落所产生的 全部蛋白质而进 行大规模研究的 方法 。
Company
Logo
研究策略 蛋白质组学研究的研究策略 2.宏蛋白质组学研究的
Company
Logo
.获取微生物蛋白 2.2 2.2.
分组收集
Text 蛋白质分子 量大小 Watanabe 等用3个不同 截留分子量 的超滤膜法 将蛋白质根 据分子量大 小分为三组 土壤蛋白质 来源和分布 实验目的 蛋白种类 后续研究方法
胞外蛋白质 •细 胞 蛋 白 •总 蛋 白
•
Company
Company
来自百度文库
Logo
3.宏蛋白质组学的应用
提供生物标志物
a.宏蛋白质组学可作为鉴定功能性微生物行之有效的方法，能够描述环 境动力学特征，提供可持续性特征的生物标志物(biomaker)。 Singleton 等曾采用整体法对土壤总蛋白进行定量，证明镉污染会导致 土壤蛋白质含量显著下降。由此可以推测对蛋白质进行定性分析有利于 寻找更灵敏的更具特异性的生物标志物。 b.2-D 凝胶电泳技术可以分析固有微生物群落的总蛋白库，并绘制蛋 白质指纹图谱。根据环境条件的不同，蛋白质指纹图谱也会随之发生 一些变化，环境条件的小变异会促进或抑制特定蛋白的表达，据此可 将这些蛋白质作为生物标志物，分析其灵敏度、特异性( 环境条件发 生小变异时) 及在不同环境中的普遍性，将其应用于一些简易、快速、 高灵敏度的试验，通过免疫学方法和( 或) 蛋白质芯片技术来评估环 境条件变化对生态系统功能的影响。
Company
Logo
2.2 .2.胞外蛋白 2.2.
� 胞外蛋白质来自裂解的细胞、细胞分泌的酶或其他活性蛋白，游 离或吸附在土壤基质上，能够被土壤通过各种机制稳定存在于土 壤基质中. 对土壤中稳定胞外蛋白质为研究对象的蛋白质组学又 称土壤结构蛋白质组学。 � 胞外蛋白的提取一般不需要裂解，用 0.22 μm的滤膜就可以达到 初步分离的目的。但由于土壤胞外蛋白的低丰度性，有时还要求 保持活性，使得对其的提取更难，电泳分离的胞外蛋白数量明显 小于胞内蛋白 .
Company
Logo
宏蛋白质组学也可以检测复杂生物途径中的复杂代谢路径
Thanks For your attention!
王秀玲
Company
LOGO
传统的分离培养方 法极大地限制了人 们认识微生物世界 的视野。
Company
Logo
1.宏蛋白质组学的产生
蛋白质组 概念的提出
宏基因组 概念的提出
宏蛋白质组
蛋白质组学是研究 一种细胞乃至一种 生物所表达的全部 蛋白质的生理结构 与代谢过程的科学 ，但是对于组成复 杂的天然样品或含 有大量不可培养微 生物的自然微生物 区系，还很不足。