银耳芽孢多糖提取方法的研究

3
1100
2
410
40
3
510
45
4
610
50
表 3 L9 (34 )正交实验结果表
实验号 A
B
C
多糖提取
D
率 (%)
1
1
1
1
1
9178
2
1
2
2
2
16144
3
1
3
3
3
13111
4
2
1
2
3
14178
5
2
2
3
1
14122
6
2
3
1
2
12100
7
3
1
3
2
29100
8
1
1
1
1
9178
9
3
2
1
3
24100
K1
3
鸡腿蘑生物量的影响程度为 : B > C > D > A , A、B、C、 D 四因素理论最佳组合为 A2 B3 C1 D2 ,即起始 pH610, 转速 170 r /m in,装量系数为 012,接种量 10%。
表 3方差分析表明 ,在设置的发酵条件四因素 中 ,摇床转速对鸡腿蘑胞外多糖含量和生物量的影 响最明显 ,其中对胞外多糖含量的影响达到了极显 著水平 ,对生物量的影响达到显著水平 。
关键词 :银耳芽孢 ,提取 ,多糖 ,复合酶 Ab s tra c t: S ix d iffe re n t m e thod s ha d b e e n us e d to e xtra c t
p o lys a c c ha rid e s from Trem e lla fuc ifo rm is sp o re s inc ub a te d in liq u id c u ltu re m e d ium 1 The re s u lt s how e d tha t the c om p ound e nzym e w ith ho t w a te r s oa k ing m e thod s w a s the b e Fra Baidu bibliotek t a nd g o t the h ig he s t p rod uc tion of p o lys a c c ha rid e s 1 The b e s t re a c ting c ond itions of c om p ound e nzym e c hos e n b y o rthog ona l e xp e rim e n t w e re : the c om p ound e nzym e 1 % , e nzym e re a c ting tim e 6 h, p H 610 a nd tem p e ra tu re 45 ℃ 1U nd e r th is c ond ition, the p rod uc tion of p o lys a c c ha rid e s re a c h to 29 % 1 Ke y wo rd s: Trem e lla fuc ifo rm is sp o re; e x tra c tion; p o lys a c c ha rid e; c om p le x e nzym e
111 材料与仪器
银耳芽孢 由本实验室提供 ; PDA 固体培养基 ; 银耳芽孢液体培养基 [4 ] ; 复合酶 (主要含果胶酶 、纤 维素酶和中性蛋白酶 ) 无锡酶制剂厂 ; 3, 5 - 二硝基 水杨酸试剂 、盐酸 、氢氧化钠 、正丁醇 、氯仿 均为国 产分析纯 。
分析天平 ,摇床 ,超声波破碎仪 ,微波炉 ,恒温水 浴锅 , 7221型分光光度计 。
法提取多糖提取率相对较低 ,复合酶结合热水浸提 法提取多糖提取率相对最高 (达到 29% ) ,超声波结 合热水浸提次之 。复合酶 (主要含果胶酶 、纤维素酶
验结果进行直观分析 ,见表 3。
(下转第 159页 )
156 2007年第 09期
工艺技术
食品工业科技 V ol . 28 , N o . 09 , 2007
中图分类号 : TS219 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 1002- 0306 ( 2007) 09- 0155- 03
银耳 ( T rem ella fuciform is B erk1) ,又名白木耳 ,雪 耳 。自古以来 ,银耳就是可以用作滋补强壮 ,扶正固 本的药物 。现代医学研究证明 ,银耳不仅是一种较 理想的滋补强壮剂 ,而且可以治疗气管炎 ,心血管疾 病 ,糖尿病等多种疾病 [1, 2 ] 。银耳多糖是银耳的主要 有效成分 ,有胞外多糖和胞壁多糖之分 。近年来 ,国 内外学者对银耳 (孢子和耳片 )孢壁多糖组分的提取 分离 、纯化 、结构分析及药效等做了大量的研究 ,其 中对银耳孢子多糖的提取一般采取热水浸提法 ,而 此法粗多糖提取率较低 (约 20% ) [3 ] 。分析其原因 , 主要是因为银耳孢子壁厚坚实 ,而要有效的提取银
耳孢壁多糖必须先进行破壁处理 。本研究以液体培 养的银耳芽孢 ( yeast- like fo rm )为研究材料 ,在热水 浸提的基础上 ,结合五种不同的辅助方法提取多糖 , 筛选出了最佳的提取方法及其最佳条件 。这对于提 高银耳芽孢的利用价值 ,进行产业化生产具有一定 的现实意义 。
1 材料与方法
馏水定容到 25mL ,摇匀 。以空白 ( 3, 5 - 二硝基水杨
酸 )调零 ,在波长 540nm 处测吸光光度值 ,绘制标准
曲线 。
2 结果与分析
211 葡萄糖标准曲线
取 0、1、2、3、4、5、6、7m g /mL 的葡萄糖 ,设置 3 个
重复 ,测吸光光度值 ,计算平均值 。根据标准葡萄糖
误差
2511569 151217 181749 261848 312138
2 31221 31110 3 2 0195 31110 2 0240 31110 2 01344 31110 8
并测定提取液中的多糖含量 ,结果见表 1。 从实验结果中可以看出 ,在六种提取方法中 ,复
合酶 结 合 热 水 浸 提 法 所 得 多 糖 提 取 率 最 高 , 达 20100% ,因而是相对最佳的提取方法 。
112 实验方法
11211 银耳芽孢的培养 将保藏的银耳芽孢从 PDA 斜面转接母种瓶 ,摇床 ( 25℃, 150 r /m in) 培养 8d; 然 后将母 种 芽 孢 接 种 至 装 有 100mL 液 体 培 养 基 的 500mL 的三角瓶中 ,摇床 ( 25℃, 150 r /m in) 培养 8d, 离心收集 ( 4800 r /m in, 25m in)并用蒸馏水洗 3次再离 心 ( 4800 r /m in, 25m in)收集 ,得到备用银耳芽孢 ( 4℃ 冰箱短期保存 ) 。 11212 银耳芽孢多糖六种提取工艺流程图
F0110 ( 2 , 8) = 31110,分析结果列于表 4。
表 4 方差分析
因素
偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
图 1 标准葡萄糖吸光光度值与葡萄糖含量的关系示意图
212 最佳提取方法的确定
采用六种提取方法提取等量银耳芽孢中的多糖
酶量 ( % ) 酶解时间 ( h)
pH 酶解温度 ( ℃)
工艺技术
食品工业科技 V ol . 28 , N o . 09 , 2007
银耳芽孢多糖提取方法的研究
吴 尧 ,马爱民 3 ,王 益 ,黄 文 (华中农业大学食品科技学院 ,湖北武汉 430070)
摘 要 :采用六种方法提取液体培养的银耳芽孢中的多糖 。结果 显示应用复合酶结合热水浸提法多糖提取率最高 ,是最佳 的提取方法 。通过正交实验 ,确定了复合酶的最佳反应条 件为 :复合酶用量为 1% ,酶解时间为 6h,酶解 pH610,酶解 温度为 45℃。在此条件下 ,多糖提取率高达 29%。
综合考虑各方面因素 ,确定鸡腿蘑摇瓶发酵条 件为 :起始 pH610,转速 170 r /m in,装量系数为 014,接 种量 10%。
212 鸡腿蘑摇瓶发酵曲线
从图 1 鸡腿 蘑摇 瓶发 酵曲 线 测 试 结 果 可 以 看 出 ,在发酵过程中 ,随着培养时间的延长 ,鸡腿蘑的生 物量不断增长 ,到第 7d达到最大值 (1192g /100mL ) ,之 后由于营养物质缺乏 ,代谢产物累积等原因 ,使原来 的生活环境 发生 了改 变 , 使其 不 再 适 于 菌 丝 的 生 长 ,菌丝体生物量开始缓慢下降 。发酵液中的胞外 多糖含量在发酵的前 2d处于很低的水平 ,第 3d开 始迅速 上升 , 到 第 6 d 达 到最 高值 ( 1146 g /L ) , 然 后 缓慢下降 。说 明 在发 酵的 第 1 d 和 第 2 d 菌 丝体 基 本未向发酵液中分泌胞外多糖 ,而第 1d和第 2d测 到的糖含量 ( 0104 g /L ) 可 能是 玉米 淀粉 在用 α- 淀 粉酶处理时未完全降解掉的少许寡糖 。从第 3 d开 始菌体大量向发酵液中分泌胞外多糖 ,到第 6d达到 最高值 ,之后由于营养物质变得不充足 ,菌体自身分 泌出的胞外多糖可能又被自身利用 ,所以胞外多糖产
收稿日期 : 2007- 02- 01 3 通讯联系人 作者简介 :吴尧 (1981- ) ,男 ,硕士 ,研究方向 :食品微生物学 。 基金项目 :湖北省科技攻关项目 (2005AA401C50) 。
2007年第 09期 155
食品工业科技 S cience and Technology of Food Industry
213 复合酶结合热水浸提法提取条件的确定
影响酶解条件的因素主要有加酶量 、酶解时间 、
方差分析结果显示 ,四个影响因素中只有 A 因 素的 F比超过临界值 ( 31221 > 31110 ) ,从而对实验结 果的影响达到显著水平 ,而 B、C、D 三个因素均未达 到显著水平 。也就是说 ,加酶量是影响银耳芽孢多 糖提取效果的最显著因素 ,因此应严格控制 。
制作标准曲线 ,以吸光光度值为 y轴 ,葡萄糖含量为
x轴 ,制作回归曲线图 ,得回归方程式 : y = 010637x +
010024,如图 1。
18133
8178
表 2 L9 ( 34 )正交设计
20100
水平 酶量 ( % ) 酶解时间 ( h)
A
B
pH 酶解温度 ( ℃)
C
D
1
0125
2
0150
3
2
1
20178
K2 131110 171853 151260 141927
K3 131667 181220 171333 191147
R 241593 151297 181777 171297
从表 3的极差值可以看出 ,四种因素中 ,影响多
糖提取的主次顺序是 : A > D > C > B ,即加酶量 >酶
色法 (波长 540nm )测定吸光光度值 ,按标准曲线的
回归方程计算 。
11214 标 准 曲 线 的 制 作 取 0、1、2、3、4、5、6、
7m g /mL 的葡萄糖标准溶液各 1mL ,分别置于 25mL
容量瓶中 ,各加入 3, 5-二硝基水杨酸溶液 2mL ,置沸
水浴中煮 2m in 进行显色 ,然后以流水迅速冷却 ,蒸
1121312 单糖含量的测定 用 315 - 二硝基水杨酸比
色法测定 [6 ] 。
1121313 总糖含量的测定 待测液中加入 6mo l /L 的
浓盐酸 ,再沸水浴加热 30m in[ 7, 8 ] , 分解多糖为单糖 ,
调 pH 至中性 ,稀释 50 倍 ,用 3, 5 - 二硝基水杨酸比
解温度 >酶解 pH >酶解时间 。由实验结果可以得
出提取的最佳条件组合是 : A3 B1 C3 D2 ,即加酶量 1% 、 酶解时间 2h、酶解 pH610、酶解温度 45℃。在此条件
下 ,多糖的提取率达到了 29%。
为进一步确定各个因素的显著性水平 ,我们对
实验 结 果 进 行 了 方 差 分 析 , 其 中 a = 0110, 查 表
3 结论
酶解 pH 和 酶 解 温 度 , 本 实 验 采 用 四 因 素 三 水 平 L9 ( 34 )正交法 ,确定最佳的酶解条件 ,见表 2。 根据正交设计 ,取等量银耳芽孢 ,分 9 组实验 , 酶解后提取银耳芽孢多糖 ,测定多糖的提取率 ,将实
311 在六种银耳芽孢多糖的提取方法中 ,热水浸提
工艺技术
表 1 六种提取方法结果
提取方法
热水浸提
高温高压结 合热水浸提
微波结合 热水浸提
超声波结合 热水浸提
液氮研磨结 合热水浸提
复合酶结合 热水浸提
多糖提取率 ( % )
6103
8133
7111
11213 银耳芽孢多糖提取率的测定
1121311 芽孢多糖提取率的计算 多糖提取率 = (总
糖 -单糖 ) /芽孢干重 ×100% 。