转基因植物生产基因工程疫苗技术

第23卷　第2期 中　国　预　防　兽　医　学　报 Vol.23,　No.2 2001年3月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Mar.　2001
转基因植物生产基因工程疫苗技术
吴建祥,周继勇,于　翠
(浙江大学动物预防医学研究所,杭州　310029)
摘要　用转基因植物生产有用的外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统,它可能替代传统的外源蛋白生产体系。

通过外源基因的瞬时表达或稳定表达方式,多种基因工程疫苗已在植物中表达成功,并保持良好的免疫原性。

本文概要介绍了国内外利用转基因植物生产疫苗的研究现状,并对转基因植物生产疫苗的潜在优势、存在的问题及其相关技术作一综述。

关键词 转基因植物;　外源蛋白;　基因工程疫苗;　载体
中图分类号　Q78; 文献标识码　B 文章编号　1008-0589(2001)02-0157-03
转基因植物生产疫苗是Mas on于1992年提出的。

该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达的一类生物技术。

利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白(N orwalk virus)、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、疟疾抗原等10多种疫苗[1～7]。

国内在利用转基因植物或病毒载体生产疫苗的研究方面还远远滞后于其它国家,有关论文报道甚少[8～11]。

1　植物作为制备基因工程疫苗生物反应器的优势
1.1　原核表达系统不能对表达产物进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化,而植物与动物细胞表达系统,可对表达产物进行糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等转译后加工,使表达产物具有良好的免疫原性和生物活性。

1.2　细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物,其要重新溶解并折叠成天然蛋白质则需要很高的成本,且发酵需要庞大设备投资;转基因植物则不存在这类问题,且植物所需要的仅是阳光和来自土壤或肥料的矿物质营养及水分。

1.3　与动物细胞培养相比,植物细胞培养条件简单,成本低廉,且具有全能性,能再生植株,基因一旦稳定整合便可长期使用。

另外,植物细胞中绝对不会含有潜在的动物或人类病原。

1.4　转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组而达到在植物体内积累多基因的目的。

1.5　重组基因工程疫苗可长期稳定的储存于植物器官或组织,有利于保存和运输。

1.6　利用转基因植物生产口服疫苗,可减去纯化过程,降低生产成本,使用方便。

　基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:30070570)　收稿日期:2000-09-252　转基因植物生产疫苗技术
分离克隆的抗原基因必须通过适当的方法转移到植物中才能生产植物疫苗。

所以,将外源基因稳定的导入农作物体内(即植物遗传转化)是植物基因工程疫苗生产的关键。

外源基因一般不能主动转移到植物细胞中,需要适当的转化方法,并借助恰当的载体才能转移到植物的基因组中。

转化成功与否以及转化效率的高低,很大程度上取决于良好受体再生系统的建立,同时对不同物种也要采用不同的转化方法[12,13]。

因此,植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物基因工程疫苗生产技术的关键。

2.1　植物遗传转化的受体系统及其特性
2.1.1　植物组织受体系统:　受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。

这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞,并形成愈伤组织。

愈伤组织可以培养成完整的转化植株。

该受体系统转化率高,可获得较多的转化植株,取材广泛、适用性广。

但再生植株无性系变异较大,转化的外源基因稳定性差,嵌合体多。

2.1.2　植物细胞原生质体:　是植物细胞除去细胞壁后的部分,是一个质膜包围的“裸露细胞”。

原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力,具有全能性。

原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作,互相之间可以发生细胞融合,而且还可以直接高效的捕获外源基因。

但缺点是嵌合体少,遗传稳定性更差,培养周期长,难度大,再生频率低。

2.1.3　生殖细胞受体系统:　是以植物生殖细胞如:花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。

目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化:一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养,诱导愈伤组织细胞,进一步分化发育成单倍体植株,从而建立单倍体的基因转化系统;二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。

由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点,如:具有全能
性的生殖细胞直接为受体细胞,具有更强的接受外源DNA 的潜能,一旦将外源基因导入这些细胞,犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果;利用植物自身的受粉过程,具有操作方法方便、简单。

不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制,只能在短暂的开花期进行,且无性繁殖的植物不能采用。

2.2　植物遗传转化的载体系统　作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。

目前的载体系统有病毒的载体系统和质粒的载体系统两大类。

2.2.1　病毒载体系统:　植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。

以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统,其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。

植物病毒的感染率很高,在较短时间内可获得较大的表达量。

但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体,故瞬时表达系统不易起始。

作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。

目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中;包括椰菜叶病毒(CaM V)、烟草花叶病毒(T M V)、豇豆花叶病毒(CP M V)和马铃薯X病毒(PVX)等。

其中在T M V载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。

2.2.2　农杆菌质粒载体系统:　质粒载体系统中最常用的质粒有:T i质粒和Ri质粒。

T i质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumef aciens)中,Ri质粒存在于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenis)中。

T i质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处,具有基本一致的特性。

但实际工作中,绝大部分采用T i质粒。

农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移和整合的天然系统[14～18]。

T i质粒有两个区域:T-DNA 区(是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生,且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir区(编码能够实现T-DNA转移的蛋白)。

T-DNA长度为12～24kb之间,两端各有一个含25bp重复序列的边界序列,在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中[18,19],研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的,而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程,因而可以用外源基因将其替换。

Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内,其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。

农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口,受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达[20]。

Vir产物能诱导T i质粒产生一条新的T-DNA单链分子。

此单链分子从T i质粒上脱离后,可以与Vir产物VIRD2蛋白共价结合,并在VIRD4和VIR B等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。

由于野生型T i质粒过于庞大,约200～800kb,为了便于重组DNA操作,研究人员对T i质粒进行了改造从而构建一系列合适的T i衍生载体。

首先除掉了野生型T i质粒T-DNA 区的一段DNA片段[21]。

例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素,从而破坏受体细胞和激素产量)。

此外需在T i质粒上加上 E.Coli复制起始位
点,使得插入外源基因的T i质粒在为一个穿梭载体,不但可在农杆菌中复制,而且便于在 E.Coli中重组操作与保存。

2.3　植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统)　人们在研究中发现在T-DNA转移过程中,Vir基因并不一定与T-DNA位于同一个质粒上,于是通过构建中间载体解决了T i质粒不能直接导入目的基因的困难。

大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性,因此研究者可以将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的T i质粒上。

这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入T i质粒的有效方法。

带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”(intermediate vector),而接受中间载体的T i质粒则称为受体T i质粒(acceptor T i plasmid),一般是卸甲载体(disarmed vector)。

所谓卸甲载体就无毒T i 质粒载体。

因为利用野生型的T i质粒作载体时影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。

因此为了使野生型的T i质粒成为基因转化的载体,必须切除T-DNA 的onc基因,而“解除”其“武装”,构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。

在这种onc-载体中已经缺失的T-DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取代。

这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA同源重组,而被其整合到onc-T i质粒载体上。

中间载体通常是多拷贝的 E.coli小质粒,这一点对T i通过体外操作导入外源基因是非常必要的。

从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体[22]。

根据两类中间载体,目前已开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统),这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体T i质粒组成。

在农杆菌内,通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T-DNA 上,形成可穿梭的共整合载体,在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。

但这类方法构建困难,整合体形成率低,一般不常用。

另一类转化体系是双元载体系统[23],它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变T i质粒即:微型T i质粒(mi2 ni-T i plasmid)和辅助T i质粒(helper T i plasmid)构成,T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上,通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。

微型T i质粒就是含有T-DNA边界缺失Vir基因的T i质粒,为一个广谱质粒。

它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(OriV),同时具有选择性标记基因。

辅助质粒为含有Vir区段但T-DNA缺失的突变型质粒,完全丧失了致瘤的功能。

因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。

其作用是提供Vir基因功能。

激活处于反式位置上的T-DNA转移。

将微型质粒转入到含有辅助性T i质粒农杆菌的途径有两条:一条是直接用纯化的微型T i质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞;另一条途径是采用三亲交配方法,三亲交配由含微型T i质粒的 E.Coli、含有助动质粒pRK2013的 E.Coli和含有辅助T i质粒的农杆菌组成。

三细菌混合后产生菌间的接合转导。

pRK2013可移入农杆菌,但
851 中　国　预　防　兽　医　学　报 2001年
由于不能自主复制而被丢失,其进入含有微型T i质粒的 E. Coli后,可促进微型T i质粒一起或分别转移入农杆菌中。

但由于pRK2013的“自杀”特性,最终在农杆菌中剩下微型T i质粒和T i质粒双元载体,此农杆菌可直接用于植物细胞转化。

双元载体不需经过两个载体的共整合过程。

因此构建的操作过程比较简单;由于微型T i质粒较小,并无共整合过程,因此质粒转移到农杆菌比较容易,且构建的频率较高。

另外,双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。

3　植物遗传转化方法
植物遗传转化方法可分两类;一类是载体介导的转化,即利用另一种生物实现基因的转入与整合。

目前这种载体有质粒载体和病毒载体两种。

相应地有两种转化方法。

即通过机械接种感染植物的病毒载体转化方法和通过农杆菌质粒介导的基因转化方法。

但由于农杆菌质粒介导的基因转化方法稳定性、重复性好,设备简单,操作方便,故应用广泛。

另一类转化方法是基因直接转化。

由于农杆菌载体转化系统对单子叶植物的局限性,同时试验表明:转化DNA整合植物基因组不一定需要特殊的T-DNA序列或结构。

根据这一事实现在发展了一系列将DNA导入植物的技术,其发展前景比农杆菌毫不逊色。

所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其它生物媒体,将特殊处理的裸露DNA 直接导入植物细胞实现基因转化的技术,因此也称为无载体DNA介导转化。

其中基因枪法最常用,而且操作简便、快速,甚至可克服无菌的困难;但缺点是转化频率低。

目前大多数只报道转化后的瞬时表达,而稳定遗传的比例很低,有待于进一步发展完善。

4　目前转基因植物生产疫苗存在的问题和对策
尽管转基因植物生产基因工程疫苗有许多优点,但就目前技术而言,仍存在疫苗在植物中的表达水平较低、提纯困难、口服时有被消化可能等问题。

为在植物中获得较高的表达水平,在进行遗传操作时应考虑下列因素:选用合适的强启动子(如花椰菜花叶病毒CaM V的35S启动子,该启动子在大多数植物细胞内都能启动外源基因的表达)、增强子和前导序列;对密码子进行优化,去除不稳定的RNA序列,选择适当的植物表达载体等方法等来实现。

为了防止口服时被消化降解,可在抗原基因附近加上一些修饰基因或吸附基因序列来保护口服疫苗不被迅速消化,从而可长时间停留在消化系统内。

为便于植物生产疫苗的提取纯化,人们发展了外源基因与植物的特异蛋白质基因及基调控序列连接的融合表达系统,使重组蛋白在植物中的表达具有器官和组织特异性,可大大提高外源蛋白的表达量。

这样可简化蛋白的提取纯化过程。

如将G US基因与油质蛋白融合表达,种子中80%的重组蛋白结合在油体上,这相当于重组蛋白富集了13倍,分离种子中的油体,通过特异性内切酶作用将G US蛋白从油体表面释放出来,从而获得有活性的G US[24]。

参考文献
[1]M as on HS,M an-kit Lam D,Arntzen C A,
1992,89:11754～11749.
[2]M offat AS.Science,1995,268(5):658～660.
[3]Haq K I,M as on HS,Clements JD.Science,1995,268:714～716.
[4]M as on HS,Ball JM,Shi JJ,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,US A,1996,93:
5335～5340.
[5]Sugiyama Y,Hamam oto H,T akem oto S,et al.FE BS letters,1995,359:
247～250.
[6]P orta C,S pall VE,Loveland J,et al.Virology.1994,202:949～955.
[7]Turpen TH,Reinl S J,Charoenvit Y,et al.Bio/technology,1995,(13):53
～57.
[8]赵克晖,王荣,赵长生,等.农业生物技术学报2000,8(1):85～88.
[9]李霞,陈杭,李晓东,等.生物工程进展,1999(19):39～44.
[10]王新国,肖成祖,用生物工程进展,1998,18:51～54.
[11]王跃驹,李刚强,刘德虎,等.生物技术通报,1997,5:21～25.
[12]Eambryuski P.Ann.Rev.G enet.,1988,22:1～30.
[13]H ooykass P JJ,Schilproort R A.Plant M olec.Biol.,1992,19:15～18.
[14]Alberts B,Bray D,Lewis J,et al.M olecular biology of the cell.3rd ed.
New Y ork and lodon:G arland Publishing,Inc.,1994.
[15]李子银,胡会庆.生物工程进展,1998,18(1):22～26.
[16]Paul J J,H ooykass,R ob A.Plant M olec.Biol.,1992,19:15～38.
[17]李宝健,曾庆平.植物生物技术原理与方法,长沙:湖南科学技
术出版社.1990.
[18]Barton K.A,Cell,1989,56:1033.
[19]Bao Y.J.Virology.,1996,70:6378～6383.
[20]S tachel SE,M essens E,Van M ontagu M,et al.Nature,1986,318:624～
629.
[21]Fraley R T.Biotechnology,1985,3:629～635.
[22]王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术,北京:科学技术出
版社,1988.
[23]An G Binary.M ethods Enzym ol.1987,153:292～305.
[24]M oloney M .Patent1997,550～554.
951
第2期 吴建祥,等.转基因植物生产基因工程疫苗技术 。