用偶氮胂M分光光度法测定蛋白质

第17卷第3期 分析科学学报2001年6月V ol.17　N o.3 JO U RN A L OF AN A L Y T ICA L SCI EN CE June　2001文章编号:1006-6144(2001)03-0214-03

用偶氮胂M分光光度法测定蛋白质

张正奇　陈永湘 张郁葱

(湖南大学化学化工学院,长沙,410082)　(湖南医科大学附二医院)

摘　要:研究了蛋白质与偶氮胂M的显色反应。在含0.050%OP的pH2.5的缓冲

溶液中,偶氮胂M与蛋白质形成兰色复合物,K max为605nm,E为4.5×105L·mo l-1

·cm-1,蛋白质含量在3.3～254mg/L范围内,服从比耳定律。所提出的方法可直接

用于血清、花生等生物样品中蛋白质含量测定。

关键词:偶氮胂M;分光光度法;蛋白质

中图分类号:Q51;O657.3 文献标识码:A

人体中血清蛋白质测定具有重要意义,是临床诊断的重要依据。人血清蛋白质临床检验项目有血清总蛋白、白蛋白、C-球蛋白、粘蛋白测定等[1,2]。其中,总蛋白的测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法和折射法。凯氏定氮法操作繁琐,双缩脲法干扰较大,折射法不能用于总蛋白量少于35g/L的样品测定。

近年,分光光度法测定血清蛋白质的报道较多[3-7]。所用显色剂有单偶氮化合物、双偶氮化合物、三苯甲烷类试剂等。用极谱法可测定蛋白质总量[8]。本文研究了偶氮胂M与蛋白质复合物的光度性质及其应用。在pH2.5的缓冲溶液中,偶氮胂M与蛋白质形成兰色复合物,K max为605nm,蛋白质含量在3.3mg/L～254mg/L范围内,服从比耳定律。

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

UV-1100型分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);78-1磁力加热搅拌器(金坛市医疗仪器厂);FSH-2型可调高速匀浆器(江苏金坛大地自动化仪器厂和环保仪器厂);LG16-W高速离心机(北京医用离心机厂)。

C-球蛋白(卫生部上海生物制品研究所);人血清白蛋白(卫生部上海生物制品研究所);牛血清白蛋白(BSA,上海伯奥生物科技公司)。称取牛血清白蛋白66mg,加水溶解,稀释至100mL,其他浓度取此液稀释;质量控制血清(临床实验室用,卫生部上海生物制品研究所和卫生部临床诊断试剂中心),冻干。上述试剂均在4℃保存;偶氮胂M溶液(5.0×10-4mol/L);乳酸-乳酸钠缓冲溶液(pH2.5)。其它试剂均为分析纯,实验用水为去离子水。

1.2　实验方法

2.00m L pH2.5的乳酸-乳酸钠缓冲溶液与0.80mL偶氮胂M溶液相混合,加入0.50%OP溶液1.00m L,混匀,用水稀释至10mL。放置15min,用2.5cm比色皿以试剂为参比,测定605nm处吸光度。

收稿日期:2000-08-21 通讯联系人:张正奇

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　Fig .1　Absorption spectra a :pH 2.5, 4.0×10-5mo l/L A r senazo M ,

0.050%O P ,m easur ed ag ainst water ;b:pH 2.5, 4.0×10-5mo l/L Ar senazo M ,25.5mg /L BSA ,measured

a gainst r eag ent ;c:b+0.050%OP 2　结果与讨论

2.1　BSA -偶氮胂M 复合物的吸收光谱

在pH 2.5的乳酸-乳酸钠缓冲溶液中,偶氮胂M 呈红色,最大

吸收波长为550nm (图1a );加入BSA ,溶液呈兰紫色,表明BSA 与

偶氮胂M 形成复合物,最大吸收波长为605nm (图1b),当有

0.050%OP 存在时,最大吸收波长不变,吸光度值增加50%(图

1c )。利用此体系不经任何预处理可直接测定生物样品中蛋白质含

量,比耳定律范围为3.3～254mg /L,在3.3～66mg /L 范围内,校正

曲线回归方程为y =0.0078x +0.003,相关系数为0.998;在66

mg /L ～254mg /L 范围内,校正曲线回归方程为y =0.0038x +0.

02,相关系数为0.997(y ,吸光度;x ,mg /L)。

2.2　显色条件试验

2.2.1　酸度的影响　在25.5mg /L BSA 、1.0×10-5mo l /L 偶氮胂M 和0.010%OP 试液中,当pH 值小于2.2时,吸光度随pH 值增大而增大;当pH 值大于2.8(B -R 缓冲溶液)时,pH 值增加,吸光度值降低;在pH 2.2～2.8范围内,吸光度值变化很小,本文取pH 值为2.5。试验了乳酸及其盐、柠蒙酸及其盐和甘氨酸-NaCl -HCl 等缓冲体系,结果表明,以乳酸及其盐为佳,我们选用乳酸-乳酸钠缓冲溶

液。

2.2.2　偶氮胂M 用量的影响　偶氮胂M 溶液用量对BSA -偶氮胂M 体系的吸光度有显著影响,在

pH 2.5缓冲溶液中,5×10-5m ol/L 偶氮胂M 溶液加入量在0.70～1.0m L 之间,吸光度值无显著差

异,本文取0.80mL,其浓度为4.0×10-5mol/L 。

2.2.3　表面活性剂的影响　试验了SLS 、CT M AB 、CPB 、OP 、T ween -60、T w een -80和Tr iton X -100等表面活性剂对BSA -偶氮胂M 复合物吸光度的影响。结果表明Tw een-60、Tw een-80和CT M AB 等使BSA-偶氮胂M 吸光度减少;SLS 和CPB 使BSA-偶氮胂M 出现沉淀;OP 使BSA-偶氮胂M 吸光度值增加。我们用OP 作增敏剂,浓度在0.025%～0.10%之间,吸光度变化很小,取浓度为0.050%。

2.2.4　温度的影响　在5～40℃范围内,温度对吸光度无显著影响,本实验在室温下进行。

2.2.5　时间的影响　13m in 后吸光度值达到最大,在24h 内稳定不变。本文取显色时间为15min 。

2.3　共存物质的影响

试验了常见阳离子、阴离子及某些有机物对BSA -偶氮胂M 体系吸光度的影响。实验结果表明,生

物体内存在的金属离子和阴离子,如K +、Na +、Ca 2+、M g 2+、Cu 2+、Zn 2+、Cl -等以及维生素、肌酐、尿酸、

葡萄糖等有机物对蛋白质的测定均无影响。

2.4　样品分析

2.4.1　质量控制血清中蛋白质含量的测定　用所提出的方法测定了质量控制血清中蛋白质含量。该血

清中各组分含量如下:K +, 4.45mm ol/L;Na +,134.8m mol/L;Cl -,92.6m mol/L;P,40.2mg /L;

Ca 2+,116.8m g/L;尿酸,70mg /L;葡萄糖,1.19g /L;肌酐,14.7m g/L;总蛋白,61.4g/L 。按照说明书,每瓶加入3.00mL 水,使其溶解。移取1.00mL ,用水稀释至100mL ,用作工作液。用标准加入法测定。取7支比色管,依次编号为1、2a 、2b 、2c 、3、4、5(1号为空白,2a 、2b 和2c 为平行样)。首先于各管中加2.00m L 缓冲溶液,1.00mL OP 溶液和0.80mL 偶氮胂M 溶液,然后向2a 、2b 、2c 、3、4、5各管中加入0.20m L 质控血清工作液,再于3、4、5各管中分别加入BSA 标准溶液0.20、0.40和0.60m L ,稀释至刻度,摇匀,放置15m in,以1号为参比测定605nm 处吸光度值,以吸光度值对BSA 浓度作图,得一直线,延长此直线与横轴相交,交点的绝对值即为所求蛋白质含量。测得上述质量控制血清标样中蛋白质含量为59.4±3.9g /L,与标称值61.4g/L 吻合。

2.4.2　回收率试验　取上述质量控制血清工作液0.20m L (蛋白质质量为0.123mg ),加入不同量的215第3期张正奇等:用偶氮胂M 分光光度法测定蛋白质第17卷