波谱学在有机化合物结构解析中的应用

波谱学在有机化合物结构解析中的应用
在研究有机化合物的过程中，往往要对未知物的结构加以测定，或要对所合成的目的物进行验证结构。

其经典的方法有降解法和综合法。

但是经典的研究方法花费时间长，消耗样品多，操作手续繁。

近代物理方法有多种，有机化学中应用最广泛的波谱方法是质谱、紫外和可见光谱，红外光谱，以及核磁共振谱，一般简称“四谱”。

质谱法是分离和记录离子化的原子或分子的方法，它的原理是以某种方式使有机分子电离、碎裂，然后按离子的质荷比大小把生成的各种离子分离，检测他们的强度，并将其排列成谱。

质谱法按其研究对象可分为同位素质谱、无机质谱和有机质谱三个主要分支。

质谱法是有机化合物结构分析的最重要的方法之一，它能够准确地测定有机化合物的分子量，提供分子式和其他结构信息；它的测定灵敏度远高于其他结构分析法，如红外吸收光谱、核磁共振谱等。

20世纪50年代实现的气相色谱与质谱的在线联系用以及随之逐步发展起来的高效液相色谱-质谱联用技术使复杂有机混合物的快速分离和定型鉴定得以实现。

从此，质谱应用范围大大扩展，在天然产物的研究以及环境污染物分析方面起到了重要作用。

近20年来，质谱各种“软电离”技术的发展成功地实现了蛋白质、核酸、多糖、多肽等生物大分子准确分子量测定以及多肽和蛋白质中氨基酸序列的测定。

质谱技术因具有检测精确度高、分析速度快、所需样品和试剂少的优点,已成为蛋白质结构研究中最重要的分析工具之一。

生物MS技术主要用于解决两个分析问题：一是精确测定生物大分子,如蛋白质、核苷酸和糖类等的分
子质量,并提供分子结构信息;二是对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析。

它在蛋白质结构的快速鉴定、序列分析、蛋白质定量分析、翻译后加工(修饰)及蛋白质相互作用等方面已有较为广泛的应用。

PMF的测定
蛋白质结构特殊,相对分子质量大,MS测定多肽和蛋白质序列是根据MS碎片离子推导的,序列信息碎片主要是通过酰胺键断裂形成。

将蛋白质绘制成肽谱是一种重要的序列测定方法。

PMF 测定是指将未知蛋白质以特定的蛋白酶酶解为多肽片段后,用MS测得各个肽片段的精确分子质量,将所得的肽质量数据与标准数据库相比对,即有可能检索到相应的蛋白质,同时可获得诸如一级结构等多方面的信息。

在PMF鉴定蛋白质中,目前最常用的方法是,采用2-DE技术将酶切得到的肽段进行分离,再利用MALDI-TOF-MS进行分析。

MALDI-TOF-MS对被测物质量误差范围有较高的要求,故MALDI-TOF-MS仪采用了离子反射器和延迟提取技术,并通过内标校正,质量误差范围可达,目前样品制备、PMF分析、数据库搜索这一过程已实现自动化,实现了蛋白质的快速鉴定和高通量筛选。

肽序列的测定
由于PMF方法只有在MALDI-TOF-MS分析得到4个以上肽段的质量且数据库中存在这种蛋白质的信息时才能正确鉴定,因此不能用于鉴定不符合上述条件的蛋白,此时需要对肽段的序列信息,即肽序列标签(PST,为蛋白质序列中的5～6个氨基酸残基片段,具有很高的特异性)进行测定。

肽序列测定方法是利用肽
段裂解技术将肽段沿肽链断裂, 形成长度仅相差一个氨基酸的一系列肽片段(肽段分子的离子),对这些碎片离子系列综合分析,即可推断出肽段的氨基酸序列。

较之传统的Edman降解末端测序技术,MS具有灵敏度高、速度快及不受末端封闭的限制的特点。

目前,广泛使用的肽段裂解技术包括CID和源后衰变(PSD)两种。

用串联MS分析多肽序列时,复杂的肽混合物无需分离即可通过CID直接测定肽段的氨基酸序列。

原理为从一级MS产生的肽段中选择母离子,在第二级MS中,进一步与惰性气体碰撞形成N端碎片离子系列(B系列)和C端碎片离子系列(Y 系列)。

孙懿等利用串联MS鉴定了与鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集和失活相关的22个差异表达蛋白质,为阐明鼻咽癌病理机制提供了依据。

近年来有人采用PSD-MALDI-MS技术测得肽序列。

Ehmann等则利用MALDI-MS在血液中寻找与胰腺癌有关的生物标记物,并对其中最具代表性的3种标记物进行肽序列分析,其诊断敏感性可达100%,诊断特异性为98%,为胰腺
癌的早期诊断提供了技术支持。

但以上两种肽段裂解技术尚存在一些缺陷:在肽键断裂时对某低能量的肽键有偏好,如脯氨酸残基的氨基端和天冬氨酸残基的羧基端;且在串联MS图谱上,难以区分Ile和Leu以及Gln和Lys。

故对于未知的肽段,目前MS测序技术还不可能取代Edman降解末端测序技术。

但FT-ICR-MS 特有的ECD可解决这些问题,故其在肽序列标签的测定方面有广阔的应用前景。

2.2蛋白质翻译后修饰的确定和鉴别
翻译后修饰(post-translational modifications),如磷酸化、糖基化等,是调控蛋白质活性和功能的重要方式,也是蛋白质结构研究的重要内容,因此确定和鉴别蛋白质的翻译后修饰具有重要意义。

由于磷酸化肽段带负电荷,而MALDI-TOF-MS
常用检测模式为正离子模式,其离子化效率低,大量非磷酸化肽段的信号抑制了磷酸化肽段的信号,且其PMF中缺少标志性离子,因此直接采用MALDI-TOF-MS 检测磷酸化修饰位点比较困难。

通常是采用MALDI-TOF-MS与碱性磷酸酶的去磷酸化作用相结合的方法来鉴定磷酸化肽段。

由于肽上的一个磷酸基团丢失,分子质量数便减少了80,通过分析磷酸酶作用前后肽谱的差异,即可确定磷酸化肽段及磷酸化位点的数目。

MALDI-TOF还可通过PSD进行翻译后修饰的分析研究。

PSD是利用亚稳离子在飞行管中裂解时释放能量,使得反射飞行MS模式下离子反射能量聚集,亚稳离子飞行时间缩短,质荷比降低,导致MS谱图发生改变,从而检测出磷酸化位点。

通常,丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段会丢失磷酸(分子质量数减少98),而酪氨酸磷酸化肽段会丢失磷酸基团(分子质量数减少80)。

TQ-MS的前体离子扫描(precursor ion scan)技术和中性丢失扫描(neutral loss scan) 模式也是磷酸化修饰分析研究较常用的手段。

前体离子扫描技术利用丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化肽段经CID后丢失磷酸基团,并在阴离子扫描模式下检测,从而鉴定出混合肽中的磷酸化肽段。

由于现代生物MS技术对于小分子检测有较高的灵敏度和准确度,所以可采用前体离子扫描检测磷酸化肽段的特征性标识。

而鉴定出磷酸化肽段后,将MS转为阳离子扫描模式,可再进行肽段的序列分析。

前体离子扫描的另一种方式是直接进行阳离子扫描。

酪氨酸磷酸化肽段因具有特征性亚胺离子(immonium,m/z:216.04),故可以在正离子模式下对其进行母离子扫描检测。

为了同时检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段,Steen等基于磷酸化氨基酸的β消除反应设计了一种化学修饰方法,即在磷酸化肽段脱磷酸基团和发
生β消除反应后,加入合成的巯基季铵,进行加成反应;然后在低能量的CID下,产生特异性小分子碎片(m/z:122.06),使这2种磷酸化氨基酸在正离子检测模式下产生特征的碎片离子而用于母离子扫描实验。

正离子模式下母离子扫描的最大优点是可直接对磷酸化肽段进行磷酸化位点和序列分析。

中性丢失扫描模式可快速选择被修饰片段,然后根据特征丢失确定修饰类型。

该技术是目前最有效的对蛋白质翻译后修饰进行识别与鉴定的最有效手段,其优点是可完全在阳离子模式下操作,而不会有前体离子扫描可能出现的阴离子模式下灵敏度下降的问题,且也可有效用于离子阱质量分析器中。

FT-ICR-MS所具有的断裂模式ECD使蛋白或多肽主链在断裂时可保留修饰基团,也就产生了携带修饰基团的肽序列标签,便于修饰基团和位点的确定。

ECD 在蛋白质翻译后的修饰研究中必将成为最有力的分析手段。

Sze等在对β-casein 蛋白(分子质量为24000)的研究中,通过等离子体ECD找到了β-2casein结构中全部磷酸化位点。

2.3蛋白质高级结构的测定
对蛋白质高级结构的测定常采用近紫外圆二色谱法(CD)、荧光光谱法以及核磁共振技术,但是这些研究手段只能检测蛋白质溶液状态下的平均构象,而不能监测蛋白质的折叠过渡中间态。

蛋白质构象中折叠的不同导致蛋白质分子中的氨其氢(H)与氘(D)放射性核素交换的速率和程度不同,H/D交换技术即是利用H/D 交换速率和程度来推测蛋白质高级结构及非共价复合物的作用位点,是一种灵敏
的探测蛋白质结构和动力学性质的方法。

ESI-MS作为一个测量放射性核素变化的工具,能准确、灵敏、快速地检测H/D交换前后样品的质量变化,从而推测出可能的结构信息;且具有样品用量少、适合分析大分子蛋白质等特点, ESI-MS与
H/D交换技术联用,已成为蛋白质三维结构研究中必不可少的分析手段。

离子迁移谱(IMS)是一种气相环境下的电泳技术,它是根据被分析物的分子质量、电荷和碰撞截面(即大小和形状)来分离和辨别被分析物。

目前将该技术与ESI、MALDI及MS技术联用于蛋白质和多肽分析研究,已取得相当大的成功,成为蛋白质结构研究中最强有力的工具。

利用IMS对多肽异构体混合物的构象研究结果表明,IMS具有分辨结构上仅存在微小差别的异构体的能力,这是普通的MS技术所不具备的。

因
此,ESI-IMS-MS联用技术在大分子结构及构象分析中具有非常突出的优势。

与ESI相比,DESI是在常压下操作的,且离子源相对简单,使得DESI更易与IMS相匹配。

Myung等将DESI与IMS-TOF联用于细胞色素C和胞壁质酶蛋白的检测,结果显示,DESI与ESI所得到的MS谱图非常相似,且DESI离子化过程更温和,更易于得到蛋白质结构的准确信息。

由此可见,将DESI与IMS联用具有更大的优势。

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