酶解法提取黑豆多糖的研究

酶解法提取黑豆多糖的研究
魏俊青，肖春玲，陆　楠，张慧敏，王君翠，张海燕
（山西师范大学工程学院，山西临汾　０４１００４）
摘　要：以黑豆为原料，采用不同种类的酶研究了提取黑豆多糖的技术，试验在不同的酶解浓度、温度、时间、ｐＨ值对黑豆多糖提取率的影响的基础上，用星点设计法优化了酶法提取黑豆多糖的最佳工艺参数。

结果表明：在用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶进行的提取中，纤维素酶法提取率最高；最优的提取参数为酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ６．０、酶解时间１２０ｍｉｎ、酶解温度５０℃、黑豆多糖得率为０．３２１４％，与理论贴近度９９．４１％，各因素对多糖得率的影响顺序为ｐＨ＞酶解时间＞酶解温度。

关键词：黑豆；多糖；酶解法；星点设计
黑豆在我国种植范围很广，其具有高蛋白，低热量的特性［１］，黑豆还具有软化血管，润皮肤，延缓衰老的作用，特别是对高血压，心脏病，肝脏和动脉等方面的疾病有一定的疗效［２］。

目前对植物中多糖的提取主要采用热水浸提法、碱浸提法、酸浸提法［３］。

热水浸提法因它的溶剂是水，原料中的多糖不容易从细胞中大量溶出；碱浸提法和酸浸提法，因为原料的结构受到了破坏，提取率相对较低。

目前利用酶解法提取多糖仅仅是在香菇、蓝莓、蛤蟆油［４－６］，而采用酶解法对黑豆中多糖的提取尚未见报道。

试验以黑豆作为原料，采用酶解法，利用星点优化设计对黑豆中的多糖提取工艺进行优化，并确定其最佳参数，以期为黑豆酶解多糖的提取工艺提供理论依据。

１　材料与方法
１．１　试验材料与试剂
黑豆购于临汾新银河超市；石油醚、无水乙醇、无水葡萄糖标准品、乙醇（９５％）、浓硫酸、苯酚、柠檬酸、氨水均为分析纯；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶均购于华科生化试剂商城。

１．２　主要仪器与设备
ｐＨＳ－３ＴＣ精密数显酸度计，上海沪粤明科学仪器有限公司；ＲＪ－ＴＤＬ－４０Ｃ台式低速大容量离心机，上海精科实业有限公司；ＵＶ－１１００型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Ｆ８０高速粉碎机，金城市金城国胜实验仪器厂。

　收稿日期：２０１２－０６－１８
　基金项目：山西师范大学大学生创新性训练项目（ＳＤ２０１２ＣＸＳＹ－０６）；山西师范大学科研课题组（８７３０４１）。

　作者简介：魏俊青（１９８８－），女，学士，食品科学。

　通信作者：肖春玲（１９６８－），女，教授，硕士，主要从事食品科学教学研究工作
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播种，种植密度为１．２万株／６６７ｍ２）处理组合的油菜产量最高，达２３２．０ｋｇ／６６７ｍ２。

另外，试验结果是在一年试验条件下获得，由于播期试验受年度间气候因素的影响，不同年度最适播期可能有所不同，存在一定的差异，如何更合理地安排播种期、科学施肥，进行标准化栽培，以提高秦优１９在适宜区的商品性和经济收益，有待今后进一步的研究和探索。

参考文献：
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１．３　试验方法
１．３．１　黑豆粉的制备　选择优质的黑豆浸泡３０ｍｉｎ，在６５℃下烘干后粉碎过４０目筛得到粉末，用石油醚脱脂，常温下干燥保存。

１．３．２　酶解法提取黑豆多糖的过程　称取１ｇ黑豆粉于１００ｍｌ的容量瓶中，加入５０ｍｌ蒸馏水混匀。

其内加入６ｍｌ的酶溶液于水浴锅中加热反应２ｈ，然后调节到９０℃，历时３０ｍｉｎ，从而促使酶活化；在３　０００ｒ／ｍｉｎ的条件下离心１０ｍｉｎ，取出上清液，加入９５％的乙醇溶液，静置，充分沉淀。

取出上清液，剩下的液体再次离心１５ｍｉｎ。

用无水乙醇来洗涤沉淀，干燥后得到粗多糖，称其质量。

最后，用蒸馏水来溶解粗多糖，测其吸光度。

１．３．３　黑豆多糖的测定　多糖含量的测定方法通常采用的是苯酚－硫酸法［７］。

以葡萄糖标准溶液为标品，得标准回归方程：ｙ＝０．０５６８ｘ－０．０１３３（０－１４μｇ／ｍｌ，Ｒ２＝０．９９８３），其中ｙ表示吸光度，ｘ表示葡萄糖浓度。

多糖的得率（％）＝粗提物中含有的多糖质量／最初黑豆粉的质量×１００％。

１．３．４　单一酶解法提取黑豆多糖试验　因纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的最适反应条件分别是温度４５－６０℃，ｐＨ　４．０－５．５；４５－５０℃，ｐＨ３．０－６．０；６０℃左右，ｐＨ　４．５－７．０［８］。

因此选择５０℃、ｐＨ５．０为酶解液条件进行试验。

试验分别
采用三种酶加入的方法，在相同的条件下进行试验，比较多糖得率。

１．３．５　黑豆多糖提取工艺优化　在３种酶试验的基础上，选择对黑豆多糖提取率最高的酶进行单因素试验，分别考察ｐＨ、酶解温度、时间、浓度对黑豆多糖提取率的影响。

根据结果，从中选出对多糖得率影响较大的３个因素。

使用星点优化设计软件对此进一步优化，最终确定黑豆多糖的最佳提取参数。

２　结果及分析
２．１　三种酶的比较
在木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶三种酶浓度都为３ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ５．０、温度５０℃、时间２ｈ的相同的条件下，比较多糖得率。

其中木瓜蛋白酶得率为０．１６８８％，纤维素酶为０．１８５４％，果胶酶为０．１３６１％。

结果表明，用纤维素酶提取黑豆多糖得率相对较高。

２．２　纤维素酶提取的单因素试验
２．２．１　不同ｐＨ对黑豆多糖得率的影响　固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，提取时间２ｈ，提取温度５０℃，考察不同ｐＨ对多糖得率的影响，结果见图１。

图１表明，黑豆多糖的得率是随着ｐＨ的变大在逐渐增大。

而当ｐＨ增加到６．０时，曲线出现峰值，如果持续增加结果反而下降。

因此，选出的最适ｐＨ为６．０。

图１　不同ｐＨ对黑豆多糖得率的影响
２．２．２　不同酶解温度对黑豆多糖得率的影响　固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，提取时间２ｈ，ｐＨ　６考察不同温度对多糖得率的影响，结果见图２。

图２看出，温度对酶的活性有一定程度的影响，多糖的得率随着温度的升高而逐渐变大，达到５０℃时，多糖的得率最大，而这以后会随着温度的继续升高，多糖的得率反而会降低。

这是因为温度除了影响多糖的浸出速度，还会影响酶的活性的大小。

因此，黑豆多糖的最佳酶解温度为５０℃。

图２　不同温度对黑豆多糖得率的影响
２．２．３　不同酶解时间对黑豆多糖得率的影响　固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，时间２ｈ，ｐＨ　６，温度５０℃考察不同时间对多糖得率的影响，结果见图３。

图３看出，多糖的得率随着酶解时间的增长呈现出上升的趋势，试验时间为２ｈ的时候，出现了最高点，如果继续增加反应时间，多糖的得率反而会下降。

因此，黑豆多糖的最佳酶解时间为２ｈ。

图３　不同时间对黑豆多糖得率的影响
２．２．４　不同酶浓度对黑豆多糖得率的影响　固定提取时间２ｈ，ｐＨ　６，温度５０℃，考察不同酶浓度对多糖得率的影响，结果见图４。

图４看出，黑豆多糖的得率会随着酶浓度的增加而逐渐增加，当浓度达到３ｍｇ／１００ｍｌ的时候，多糖的得率为最大，因此黑豆多糖的最佳酶浓度为３ｍｇ／１００ｍｌ。

图４　不同酶浓度对黑豆多糖的影响
２．３　星点设计优化提取黑豆多糖的工艺参数试验２．３．１　试验设计　用酶浓度为３ｍｇ／１００ｍｌ，确定ｐＨ（Ｘ１），酶解温度（Ｘ２），酶解时间（Ｘ３）３个变量对多糖得率的影响，因素和水平见表１。

表１　星点设计因素水平
因素编码
编码水平
－１．６８－１　０　１　１．６８ｐＨ　Ｘ１４．３２　５．０　６．０　７．０　７．６８酶解温度Ｘ２３３．２　４０　５０　６０　７６．８
酶解时间Ｘ３０．３２　１　２　３　３．６８２．３．２　星点试验设计结果　由Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘ－
ｐｅｒｔ７．１．６软件［９］可知３因子５水平的组合设计
为２０个试验方案，试验结果见表２。

表２　星点试验设计及结果
试验序号
水平多糖得率（％）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３试验值预测值１－１．６８　０　０　０．１３３０　０．０９８
２　１．６８　０　０　０．１５０２　０．３２０
３－１　１　１　０．１３３４　０．１２０
４　１　１－１　０．０８１５　０．１３０
５　１－１－１　０．０８２１　０．１００
６　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
７　１　１　１　０．０９２９　０．１４０
８　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
９　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
１０　０　１．６８　０　０．１２６８　０．３２０
１１　０－１．６８　０　０．２１２４　０．３２０
续表２
１２－１－１－１　０．１１３７　０．１３０
１３　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
１４　１－１　１　０．１００９　０．１６０
１５　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
１６－１－１　１　０．１０８７　０．１３０
１７　０　０　０　０．３２１４　０．１３０
１８　０　０－１．６８　０．１７３８　０．１１０
１９　０　０　１．６８　０．１２４５　０．１２０
２０－１　１－１　０．０９３６　０．１１０
根据表２，在α＝０．０５，剔除不显著项后，建立的回归方程为：
Ｙ＝０．３２－４．６８１Ｅ－００３Ｘ１－０．０１１Ｘ２－１．３１２Ｅ－００３Ｘ３－１．６５０Ｅ－００３Ｘ１Ｘ２－５．７５０Ｅ－００４Ｘ１Ｘ３－０．０７３Ｘ１２－０．０６３Ｘ２２－０．０７０Ｘ３２其中：Ｙ为多糖得率的预测值；Ｘ１为ｐＨ的编码值；Ｘ２为酶解温度的编码值；Ｘ３为酶解时间的编码值。

表３　回归模型方差分析
变异来源平方和自由度均方Ｆ值Ｐ值显著性模型０．１７　９　０．０１９　１７．６６＜０．０００１＊＊Ｘ１２．９１３Ｅ－００４　１　２．９１３Ｅ－００４　０．２７　０．００５７＊＊Ｘ２１．６０３Ｅ－００３　１　１．６０３Ｅ－００３　１．４６　０．０５０７
Ｘ３２．３４９Ｅ－００５　１　２．３４９Ｅ－００５　０．０２２　０．０３３４﹡Ｘ１Ｘ２２．１７８Ｅ－００５　１　２．１７８Ｅ－００５　０．０２０　０．００２６＊＊Ｘ１Ｘ３２．６４５Ｅ－００６　１　２．６４５Ｅ－００６　２．４５３Ｅ－００３　０．０３５６＊Ｘ２Ｘ３１．７４８Ｅ－００４　１　１．７４８Ｅ－００４　０．１６　０．６９５７
Ｘ１２　０．０７６　１　０．０７６　７９．２９　０．０００１＊＊Ｘ２２　０．０５７　１　０．０５７　５２．４１　０．００２３＊＊Ｘ３２　０．０７０　１　０．０７０　６５．２１　０．０００１＊＊残差０．０１１　１０　１．０７８Ｅ－００３
失拟误差０．０１１　５　２．１５７Ｅ－００３　０．７０　０．２８３０
纯误差０．００３　５　０．００３
总和０．１８　１９
２．３．３　双因素交互作用分析　由表３知，回归模型Ｐ值＜０．０００１，可知该模型高度显著，可以用来进行预测，模型失拟项不显著，说明该模型选择合适［１０］；因素Ｘ１对黑豆多糖得率的线性效应是极显著，Ｘ２的影响不显著，而Ｘ３影响显著。

Ｘ１Ｘ２、Ｘ１Ｘ３交互影响是显著的，Ｘ２Ｘ３的影响不显著。

但是Ｘ１２、Ｘ２２、Ｘ３２的影响是极显著的。

依据试验结果，作出Ｘ１与Ｘ２、Ｘ１与Ｘ３交互作用的三维空间响应面图和等高线图［１１］，如图５、图６所示。

图５　ｐＨ与酶解温度的星点设计图和等高线
图６　ｐＨ与酶解时间对多糖得率的星点设计图和等高线
图５看出，当时间一定时，ｐＨ与酶解温度的交互作用比较显著。

当酶解时间在２ｈ（零水平）时，随着ｐＨ与酶解温度的逐渐变大，黑豆多糖的得率显著增加，之后呈下降趋势，坡度较缓。

图６看出，当酶解温度是５０℃时，而ｐＨ与酶解时间之间的交互作用影响也比较显著；当ｐＨ逐渐变大时，黑豆多糖得率随时间的延长先增加后减少。

经过分析可知：ｐＨ、酶解温度、酶解时间对多糖得率的影响的强弱顺序［１２］依次为ｐＨ＞酶解时间＞酶解温度；纤维素酶法提取黑豆多糖的最佳条件为ｐＨ５．９７，酶解温度４９．１℃，酶解时间１１９ｍｉｎ，在此条件下，黑豆多糖得率为０．３２３３１７％。

为便于指导实际生产，将最优组合定为：ｐＨ６，酶解温度５０℃，酶解时间２ｈ，在此条件下，进行验证试验，重复３次，取平均值，测得黑豆多糖的得率为０．３２１４％。

与理论值的接近程度为９９．４１％。

试验优化得到的参数可行，进一步验证了数学回归的可行性。

３　结论
（１）试验以去皮脱脂的黑豆为原料，从酶解浓度、ｐＨ、酶解温度、酶解时间、这四个水平条件下来考虑多糖的得率。

其中用果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶三种酶来分别提取，比较其黑豆多糖的提取率，确定纤维素酶是提取率最高的酶最好的酶。

（２）ｐＨ、酶解温度、酶解时间对多糖得率的影响的强弱顺序依次为ｐＨ＞酶解时间＞酶解温度。

（３）在单因素试验的基础上，对纤维素酶的提取参数采用星点设计试验优化，所得结果为：ｐＨ５．９７，酶解温度４９．１℃，酶解时间１１９ｍｉｎ，在此条件下，黑豆多糖的理论得率为０．３２３３１７％，考虑生产方便，采用ｐＨ５．５、酶解温度５０℃、酶解时间２ｈ、酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，多糖的得率为０．３２１４％。

与理论值的接近程度为９９．４１％。

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