提取香菇多糖的详细方案

原料：香菇。

NaHCO固体，浓硫酸，95%乙醇稀盐酸，PH试纸，复试剂：蒸馏水，葡萄糖，苯酚，铝片，3
合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1），
设备和仪器：100ml容量瓶，6个50ml容量瓶，玻璃棒，蒸馏装置（温度计、沸石、三口烧瓶、冷凝管），烧杯若干，锥形瓶若干，棕色瓶一个，抽滤瓶，1、2、5、10ml吸液管，
电子天平，真空干燥箱，恒温水浴锅，紫外分光光度计，粉碎机，40、60、80、100
目的筛子，DL700-0.55×1.5超高压等静压机（上海大隆高压设备厂），真空泵，
THZ-82A台式恒温振荡器，台式离心机。

1、标准葡萄糖溶液的配制
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.0mg，加蒸馏水溶解并定容于100ml容量瓶中，摇匀，配成浓度为1mg/ml标准葡萄糖溶液备用。

2、5%苯酚试剂的配制。

苯酚水浴加热溶解后称取100g，加铝片0.1g(先用1：6的盐酸除去铝片表面氧化铝后，再称量使用)，加入碳酸氢钠30g，蒸馏，收集178-182℃的馏分，取馏出液7.5g，加入蒸馏水150mL，得5.0％的苯酚溶液，置于棕色瓶中备用。

3、标准曲线绘制
以葡萄糖作为标准品，采用苯酚—硫酸比色法，用紫外分光光度计测定多糖含量。

精密吸取已配制的葡萄糖标准品溶液0.5，1，1.5，2，2.5，3ml置于6个50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，摇匀。

精密吸取2ml，分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，以溶剂蒸馏水为空白作对照，在400～600nm内扫描，最大吸收波长为490nm。

在490nm处，测吸光值，以浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制标准曲线，得出葡萄糖标准品浓度Y（ug/ml）与吸光值X的回归方程：Y=15.336X-0.0298，R2=0.9997。

在2.5～15.0 ug/ml 范围内呈线性关系。

预处理：
将新鲜清洗干净，除去其根部，将剩下的菌伞挤压，切小块放入真空干燥箱干燥，待香菇恒质量，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的香菇粉依次通过40，60，80，100目的筛子，得到40目以下、40～60目、60～80目、80～100目、100目粒度以上的样品，过筛之后把各级香菇粉分别装到清洁干燥的烧杯中，编号贴上标签，置于真空干燥箱中待用。

热水法提取香菇多糖的方案
原料：香菇。

试剂：0.5%NaOH，95%乙醇，蒸馏水。

设备和仪器：烧杯（若干），玻璃棒，温度计，锥形瓶（若干），漏斗，水浴锅，称量天平，THZ-82A 台式恒温振荡器,台式离心机，紫外线分光光度计。

提取的方法与步骤：
1、粉碎度对提取率的影响
分别称取40、60、80、100目的香菇粉5g，放入到250mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，混合均匀后置于90℃水浴锅中，水浴提取2h，提取两次，提取结束，冷却至室温，将两次提取液混合后过滤，取2ml滤液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm 处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到粉碎度与提取率的关系。

2、料液比对提取率的影响
称取80目的香菇粉5g六份，放入到250mL的锥形瓶中，分别加入蒸馏水75、100、125、150、175、200ml，混合均匀后置于90℃水浴锅中，水浴提取2h，提取两次，提取结束，冷却至室温，将两次提取液混合后过滤，取2ml滤液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到粉碎度与提取率的关系。

3、提取温度对提取率的影响
称取80目的香菇粉5g，放入到250mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，混合均匀后置于65、75、80、85、90、95、100℃水浴锅中，水浴提取2h，提取两次，提取结束，冷却至室温，将两次提取液混合后过滤，取2ml滤液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到粉碎度与提取率的关系。

4、提取时间对提取率的影响
称取80目的香菇粉5g五份，放入到250mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，混合均匀后置于90℃水浴锅中，水浴提取2、3、4、5、6h，提取结束，冷却至室温，将两次提取液混合后过滤，取2ml滤液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到粉碎度与提取率的关系。

5、提取次数对提取率的影响
称取80目的香菇粉5g四份，放入到250mL的锥形瓶中，加入蒸馏水100ml，混合均匀后置于90℃水浴锅中，水浴提取2h，提取1、2、3、4次，提取结束，冷却至室温，将两次提取液混合后过滤，取2ml滤液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到粉碎度与提取率的关系。

复合酶法提取香菇多糖的方案
原料：香菇，
试剂：蒸馏水，稀盐酸，PH试纸，复合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1），滤纸
设备和仪器：真空干燥箱，粉碎机，40、60、80、100目的筛子，烧杯（若干），三角瓶（若干），水浴锅，量筒，漏斗，称量天平，THZ-82A台式恒温振荡器，台式离心机。

提取的方法与步骤：
单因素实验条件确定：
1、物料粒度对香菇多糖提取率的影响
分别称取40目以下、40～60目、60～80目、80～100目、100目粒度以上的香菇粉各2g，放入到250mL的三角瓶中，标号贴上标签，各加入蒸馏水30mL（料液比1∶15），混合均匀后置于50℃水浴锅中，水浴1h，调节PH至6.5;称取适量的按一定比例混合的复合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1），放入100mL的烧杯中，加入5ml蒸馏水溶解，香菇溶液放在水浴中预热至酶解温度55℃，将酶液加入到香菇溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，过滤，将三角瓶放到沸水锅中，10min沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至4000r/min离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液;将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到物料粒度与提取率的关系。

2、料液比对香菇多糖提取率的影响
准确称取80～100目粒度的香菇粉5份，每份2g，放入到250mL的三角瓶中，标号贴上标
签，分别加入蒸馏水20mL（料液比为1∶l0），30mL（料液比为1∶15），40mL（料液比为1∶20），50mL（料液比为1∶25），60mL（料液比为1∶30），混合均匀后置于50℃水浴锅中，水浴1h，调节PH至6.5;称取适量的按一定比例混合的复合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1），放入100mL的烧杯中，加入5ml蒸馏水溶解，香菇溶液放在水浴中预热至酶解温度55℃，将酶液加入到香菇溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，过滤，将三角瓶放到沸水锅中，10min沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至4000r/min离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液;将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到料液比与提取率的关系。

3、复合酶浓度对香菇多糖提取率的影响
准确称取80～100目粒度的香菇粉6份，每份2g，放入到250mL的三角瓶中，标号贴上标签，分别加入蒸馏水40mL（料液比为1∶20），混合均匀后置于50℃水浴锅中，水浴1h，调节PH至6.5;分别称取适量的按一定比例混合的复合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=2：1）0.002g（为香菇粉干质量的0.1%），0.004g（为香菇粉干质量的0.2%），0.006g（为香菇粉干质量的0.3%），0.008g （为香菇粉干质量的0.4%），0.010g（为香菇粉干质量的0.5%），0.012g（为香菇粉干质量的0.6%），放入100mL的烧杯中，标号贴上标签，加入5ml蒸馏水溶解，香菇溶液放在水浴中预热至酶解温度55℃，分别将酶液加入到香菇溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，过滤，将三角瓶放到沸水锅中，10min沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至4000r/min 离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液;将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到复合酶浓度与提取率的关系。

高压提取香菇多糖的详细方案
NaHCO固体，浓硫酸，葡萄糖
试剂：蒸馏水，苯酚，铝片，3
设备和仪器：100ml容量瓶，玻璃棒，蒸馏装置（温度计、沸石、三口烧瓶、冷凝管），电子天平，紫外分光光度计，1、2、5、10ml吸液管，水浴锅，DL700-0.55×1.5超高压
等静压机（上海大隆高压设备厂），真空泵，抽滤瓶。

提取的方法与步骤：
1、溶剂的选择实验
准确称取100目的香菇粉5份，每份1g，放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水、5%乙醇、10%乙醇、95%乙醇、甲醇不同的溶剂，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡24h，然后将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:500MPa；保压时间:5min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到选择的溶剂与提取率的关系。

2、浸泡时间的选择实验
准确称取100目的香菇粉9份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，，分别加
入50ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡时间分别为0，1，2，3，4，6，8，12，24h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:200MPa；保压时间:2min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到浸泡时间与提取率的关系。

3、压力的选择实验
准确称取100目的香菇粉8份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，，分别加入50ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，压力分别为0，50，100，200，300，400，500，600Mpa，保压时间为2min，然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm 处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到压力与提取率的关系。

4、料液比例的选择实验
准确称取100目的香菇粉5份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，，分别加入10，30，50，70，100ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:200MPa；保压时间:2min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到料液比与提取率的关系。

5、保压时间选择实验
准确称取100目的香菇粉5份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，，分别加入50ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，分别做压力为200MPa、300Mpa的实验，保压时间分别为2，5，10，15，20min；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到保压时间与提取率的关系。