绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

专题介绍Special Topics

收稿 2002 03 21 修定 2002 08 08

资助 国家重点基础研究计划项目(项目编号:2001CB109002)。 * 联系人。

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

赵 华

1,2

梁婉琪2 杨永华1 张大兵

2,*

(1

南京大学生命科学学院生物科学与技术系,医药生物技术

国家重点实验室,南京210093;2

上海市农业科学院生物技术中心,上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)

Green Flu orescent Protein and Its Application in Plant Molecular Biology

ZHAO Hua

1,2

,LIANG Wan Qi 2,YANG Yong Hua 1,Z HANG Da Bing 2(1

S tate Key Laboratory o f Pharmac eutical Biotec hnology,De partment of Biological

Sc ienc e and Technology ,Sc hool o f L i f e Scie nce,Nanj ing University,Nanj ing 210093;2

Shanghai K e y L aboratory of Agricultural Genetics and Bree ding ,A gri biote ch Rese arc h Cente r ,Shanghai Academy of Agricultural Scienc es,Shanghai 201106)

提要 绿色荧光蛋白(GF P)是海洋生物水母(A equor ia v ictor ia )体内的一种发光蛋白,近十年来成为在生物化学和细胞生物

学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。

关键词 绿色荧光蛋白;GF P;变种;植物分子生物学

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质。其独特之处在于它的受激发无种属特异性,产生荧光无需底物或辅助因子,发色团是由其蛋白质内部第65~67位的Ser Tyr Gly 自身环化和氧化形成,并且与GFP 融合表达的蛋白质在细胞内仍能行使正常功能。1 绿色荧光蛋白的发光特性

发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象。许多腔肠动物在受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,刺胞亚门的动物多发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。

1962年,Shimomura 等[1]首先从多管水母(Ae quor ia victor ia )中分离出一种称为水母蛋白(ae quorin)的蛋白,它是分子量为20kD 的单一多肽链。1mol 的水母蛋白结合3mol 的Ca 2+及1mol 非共价键结合的腔肠动物荧光素后,可发射蓝色荧光。由于水母整体发光及提取的颗粒都是呈绿色,因此将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。现已证实GFP 是生物发光过程中能量转移的最后受体,可接受来自动物体内荧光素酶 氧化荧光素激发态复合物或转移钙依赖光蛋白释放的能量,从而发出绿色荧光。

2 绿色荧光蛋白的基本特点

随着不断地深入研究,人们发现,从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequoria)和

海紫罗兰科(Renilla)的绿色荧光蛋白,即Aequoria GFP 和Renilla GFP 。其中对前者的研究相对更深入一些,应用也更为广泛。

2.1 生化和荧光性质 绿色荧光蛋白是酸性,球状。Aequoria GFP 是分子量为27~30kD,含238个氨基酸的单体;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。两种GFP 有不同的激发光谱,Ae quoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。两种GFP 发射光谱基本相同( max =508~509nm)。这说明两种蛋白质含有相同的生色团,而激发光谱不同可能是由于GFP 生色团周围环境不同所致[2]。

GFP 是一种结构非常稳定的蛋白质,其光谱特性一般不受变性溶液的影响。Renilla GFP 对6mol L -1盐酸胍、8mol L -1尿素或1%SDS (低于45 )具有抗性。

2.2 生色团 生色团是GFP 发出荧光的物质基础,GFP 的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内。65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成GFP 生色团的核心(图1)[3]。

图1 多管水母中GF P生色团的化学结构和附近序列[3]

目前,GFP生色团的形成机制尚不清楚,人们推测其生色团的形成必须经过氧化脱氢步骤[4]。2.3 三维结构 1996年,Yang等[5]解出了重组野生型A.victor ia GFP晶体结构,Orm 等[6]则解出了突变型A.victoria GFP(S65T)的晶体结构。

绿色荧光蛋白的折叠方式非常特殊,Yang等称之为 罐( can)。11条 桶状结构( barrel)绕成一个圆柱体,1条 螺旋( helix)缠绕在圆柱体的轴位置,生色团附着在 螺旋上,包埋于中心。在圆柱体的顶端,有一些螺旋片,圆柱体的直径约30 ,长约40 [5]。

由于绿色荧光蛋白具有独特的 罐结构,因此,它表现了以下独特的特性:(1)性质稳定,不易变性;(2)生色团的光谱特性与它的包埋方式相关;

(3)由于GFP 罐表面两端结构有一定的柔性,因此GFP的独特三维结构不会被融合蛋白破坏。绿色荧光蛋白能与多种蛋白质的N末端或C末端融合,而不失去天然蛋白质的特性。

2.4 编码绿色荧光蛋白的基因 1992年,Prasher 等[7]首次克隆得到水母A.victor ia GFP基因。他们根据GFP的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片段,以此作为探针,从水母A.v ictoria的cDNA 文库中筛选到3种gf p阳性克隆,GFP基因由3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。后来的研究中用到的许多GFP突变体都是在其基础上通过改变若干碱基而得到的。

3 在植物分子生物学研究中的应用

由于绿色荧光蛋白荧光稳定,不需任何反应底物及其它辅助因子,无种属限制,已在多种生物细胞中表达成功并产生荧光。一系列对与GFP的N 端或C端融合的蛋白质性质的研究表明,融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质和配体蛋白质功能,即使在甲醛或戊二醛固定的细胞中,荧光也不受影响,适用于与其他荧光试剂同时进行的双标实验。同时,绿色荧光蛋白的检测十分方便,用基因枪转化的受体细胞组织瞬间表达和整株植物,都可以用手提紫外灯观察。用普通荧光显微镜,以蓝光或紫光激发,再选择适合的滤光片,就可以看到细胞内GFP荧光。一些非绿色组织,如根和幼胚等,在蓝光激发下产生黄绿色荧光,但这种自发荧光很弱,通过调整光圈减少进光量,或选择适合的滤光片就可以消除背景,从而检测出GFP荧光。所以检测GFP时一般不会出现假阳性结果。如要观察组织内部GFP荧光,又不损伤材料,可以使用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy),它可以对组织内部进行分层扫描,也可进行三维显示,是目前理想的荧光检测仪器。另外,荧光激活的细胞分选仪(也叫流式细胞仪)也可检出转化细胞[8]。由于这些优点,GFP基因被用作遗传标记和报告基因,在植物分子生物学研究中得到了广泛应用。

3.1 GF P的改造 1994年,Chalfie[9]、Inouye和T suji[10]分别在异源细胞成功表达了能发射绿色荧光的GFP,之后,GFP越来越受到人们的广泛关注。由于野生型GFP具有一定的缺点,如用蓝光激发时,其荧光强度较低,GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大,表达量较低等,限制了GFP的应用。1995年,H eim等[11]采用定点突变方式,把第65位丝氨酸换为苏氨酸(S65T)或胱氨酸(S65C),生色团形成速度比野生型GFP 快4倍,荧光强度提高了4~6倍,而且激发光谱和发射光谱红移,与Renilla GFP相似。此后,人们根据不同的研究需要,不断地对GFP进行改造,以改善其性能。表1是在植物基因工程中最常用的GFP变种。

3.2 GFP的毒性 人们曾一度认为GFP对植物细胞有毒。H aseloff和Amos[13]报道,转GFP基因拟南芥的愈伤组织不能分化成再生植株,推测绿色荧光的光子干扰会产生自由基,对细胞核造成氧化损伤。但许多研究人员并没有观测到GFP对植物细胞明显的毒性,认为GFP对植物细胞有毒的证据不足。动物和植物的适应性不同,植物的形态、生理特征使其能适应光线,而动物细胞可能会受到灼伤。所以,对植物来说,GFP没有毒性。Jordan[14]认为单子叶植物和双子叶植物对GFP的耐性不同, Harper等[15]在田间试验中也证明GFP没有毒性。