药敏(比例法)

DW 2ml
1mg/ml 10-2
10-4 0.01 ml (10-4 mg/ 10-6 mg)
DW 2ml
悬浮分散菌
分散前
分散后
接种及培养

用22 SWG标准接种环分别取1环 （即 0.01ml ）10-2mg/ml和 10-4mg/ml的菌液， 用划线法均匀接种至对照及含药培养基表 面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养 基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。 接种后的培养基置于 37 ℃培养，至四周后 报告结果。

非结核分枝杆菌特点
由于许多非结核分枝杆菌菌株对常用的异 烟肼、链霉素等耐药，但对利福平有一定 敏感性;现多主张用利福平、乙胺丁醇和异 烟肼联合使用。 溃疡分枝杆菌则仅对卡那霉素等氨基糖苷 类抗结核菌药物敏感，但鸟-胞内分枝杆菌 耐药性强;有报道分出的23株全部对上述药 物耐药;而通过结构改造的新型红霉素，如 克拉红霉素在体内外有很好的抗结核菌活 性，可破坏细胞壁和细胞膜结构，对鸟-胞 内分枝杆菌血培养清除率达62%—98%。

非结核分枝杆菌特点

非结核分枝杆菌经治疗后也常出现L型 ，耐药性增高，有的经多年治疗不愈。 且L型往往因细胞壁脂质缺失不易致敏 淋巴细胞，结核菌素试验可呈阴性，诊 治时应多加注意。
谢谢大家
PNB选择性培养基

结果报告 ◦ 对照培养基和PNB培养基上均生长 非结核分枝杆菌复合群NTM ◦ 对照培养基上生长很好，但PNB培养 基上未生长或几个菌落 结核分枝杆菌复核群 ◦ 对照和PNB培养基上均未生长 不能判读结果需重做
非结核分枝杆菌复合群（NTM）
非结核性分枝杆菌（NTM)系指分枝杆菌属 中，除结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非 洲型和田鼠型结核分枝杆菌)和麻风分枝杆菌 以外的分枝杆菌，由NTM引起的疾病称为非 结核性分枝杆菌病。 近年来由于检出率逐渐增多，相应的对其引 起的各种疾病的认识也在逐渐提高。 非结核性分枝杆菌中大多数为腐物寄生菌， 毒力低，属于条件致病菌。 非结核性分枝杆菌病的症状可有肺内、肺外 之分，肺外感染可涉及皮肤、骨骼和淋巴结 等。
含药培养基的制备
药物储存液的制备：

在无菌容器内称取少量药物粉末，按不同药物 出厂标定的效价精确计算其有效含量。 计算每种药物应加入的溶剂体积，使得药物浓 度为： INH 20 μg/ml， SM 400 μg/ml， RRP 4000μg/ml，EMB 200μg/ml。 INH 、 SM 和 EMB 用灭菌蒸馏水溶解， RFP 用少量 二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量。 制成储存液，分装冻存，备用。

非结核分枝杆菌特点

NTM广泛分布于自然界的土壤、尘埃 、流水和生牛奶中。显微镜下NTM形 态与结核杆菌相似，抗酸染色呈红色， 但在培养、生化特性与结核杆菌不同。
非结核分枝杆菌特点
非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮 沸试验加以区别。 非致病株煮沸1min即失去抗酸性，而 致病株能耐10min，甚至高压灭菌亦不 失去抗酸性。 结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别 ，除热触酶试检外，可将菌苔置含盐水 小滴的玻片上研磨，前者不易乳化而后 者容易乳化。
药 物 敏 感 性 试验 （比 例 法）
新疆CDC 结防中心 李月华 2015年11月6日
比例法原理
对照培养基(drug-free) 含药培养基
所有菌落均生长
仅耐药菌生长
目的
用于诊断耐药结核病 结核病治疗方案的选择 用于耐药监测

3
药敏试验的基本步骤

含药培养基的制备-购置成品 菌液制备和稀释 接种 培养 报告结果
菌悬液制备
准备磨菌瓶

磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装 入约 10 个直径 3mm 的玻璃珠，高压灭菌后待 用。
菌悬液制备
磨菌瓶法： 在磨菌瓶中加入 1 ~2滴 5%吐温 -80，用无 菌吸管尖端或灭菌接种环刮取 2-3 周的新鲜 菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处 的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋约 20-30秒。


含药培养基的制备

每次制备培养基前取出 1 管储存液，室温融化，按实 际需要量每100 ml基础培养基中加入1 ml药液，充分
混匀。

分装至螺旋盖无菌培养管 , 每管 7ml, 斜置培养基蒸 汽凝固灭菌器内, 85℃凝固50分钟，即制成含药培养
基。

凝固灭菌后的培养基自然冷却后，置 35-37 ℃孵育 24 小时。检查培养基污染情况后置 4℃保存，1个月内用 毕。

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含药培养基的制备
基础培养基：无淀粉改良罗氏培养基。
天门冬素 KH2PO4 MgSO4.7H2O 枸橼酸镁 丙三醇 蒸馏水 新鲜鸡卵液 2%孔雀绿 3.6 g (或谷氨酸钠7.2g ） 2.4 g 0.24 g 0.6 g 12 ml 600 ml 1000 ml 20 ml
含药培养基的制备
1 2 3 4 5 6 7
初步菌种鉴定
基于培养的检测
生长速度 是否产生色素 生长温度 典型形态 选择性抑制(PNB培养基)

生长速度

快速生长: 1周内
◦ 不是 TB
生长缓慢: 通常 3 周, 有时达到6 周
◦ 可能为TB
生长温度

孵育:

36 +/-1°C
M.tuberculosis 在过低或过高
*Proportion
推荐的临界浓度 7H10 7H11 0.2 0.2 1.0 1.0 5.0 7.5 2.0 2.0 — — 5.0 6.0 4.0 — 4.0 — 2.0 2.0 1.0 — 0.5/2.0 — 1.0 — 5.0 10.0 — — 2.0 8.0 — —
MGIT 960 0.1 1.0 5.0 1.0 100.0 2.5 1.0 2.5 2.0 1.5 0.5/2.0 — 5.0 2.5 4.0 —
基础培养基制备：

盐溶液：精确称取各盐类成分，加蒸馏水 600 ml ， 沸水浴溶解，待冷后, 加入丙三醇和 2%孔雀绿, 混 匀。 鸡卵液：将新鲜鸡卵洗净，用75%酒精纱布擦拭消毒 后打碎，搅匀，经消毒纱布过滤，定量至1000ml。 培养基基础液：将过滤后的鸡卵液加入盐溶液中， 充分混匀，静置约1小时。
取菌
磨菌
程序
接触所有菌落 静置15 min ,转移上清 至比浊管
Sterile distilled Water或5% 吐温80
玻璃珠
涡旋
菌悬液制备
磨菌瓶法：
加入灭菌的生理盐 水，直至其浊度与 标准麦氏比浊管 （MacFarland No.1） 一 致 ， 即 得 到 1mg/ml的菌液。
0.1 ml of 1% BaCl2 + 9.9 ml of 1% H2SO4
分装 凝固
1ml
1mg/ml菌悬液
100倍稀释
接种0.01ml
10-2 mg/ml
100倍稀释
含药培养基
对照培养基
接种0.01ml
10-4 mg/ml
练习：结果的解释
编号 对照 －2 －4 4＋ 1＋ 20 3＋ 20 3＋ 20 3＋ 20 3＋ 3＋ ＋ 15 1 含药 －2 －4 － － 5 1＋ 15 － 30 － 10 － C C － － 结果？
若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌 对该抗结核药耐药。
结果判读
-2 -4 -2 -4
对照 Inoculum 10-2 10-4 % resistant Interpretation ++++ 26
Isoniazid Ethambutol ++ 9 34.6 Resistant 3 0 0.1 Susceptible
菌液稀释
菌悬液静置片刻，使其中的颗粒或菌块沉 淀，用22 SWG标准接种环或微量吸管无菌操 作逐步稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml。 22 SWG 标准接种环：金属丝直径 0.7mm ， 接种环内径3mm，1满环移液0.01ml。
稀释菌
0.02 ml 0.02 ml
GC
H
R
S
E
McF No.1
的环境下均不生长

42°C

蟾分枝杆菌
色素产生情况
◦ 不产生色素 ◦ 产生色素 TB 非TB
菌落形态
M.tuberculosis
菌落形态
M.chelonae(龟型分枝杆菌)
M.Phlei（草分枝杆菌）
PNB选择性培养基


对照培养基
含PNB 培养基 37°C孵育，28天后 报告结果
药敏试验时选择10-2稀释浓度菌液用滴管或移液器接 种0.1ml(2-3滴)

实验室安全

实验室合理布局 涡旋振荡、接种时容易产生气溶胶， 应注意正确操作 振荡后不能立即打开瓶盖，需静置 片刻 接种时禁止反复吹吸 操作中一旦标本溅落，立即以5%石炭 酸覆盖，至少30分钟

比例法药敏试验流程
基础液 改良L-J 药物储存液 2-3周 新鲜菌落
磨菌
100ml
分装 凝固 混合、摇匀

取菌液*
结果报告
按以下方式记录菌落生长情况：
少于50个菌落：
50-100个菌落：
实际菌落数
1+
100-200个菌落：
大部分融合（200-500个菌落）： 融合（大于500个菌落）：
2+
3+ 4+
结果报告
计算耐药百分比：
含药培养基上生长的菌落数 耐药百分比= -------------------------- × 100% 对照培养基上生长的菌落数
质量控制

若高稀释度菌液（ 10 -4 mg/ml, 低接种菌 量）在对照培养基上生长的菌落数少于 20 个菌落，则应从对照管传代培养，重 复试验。 每批实验均需增加 H37Rv 标准菌株，若 标准菌株生长异常，则本批实验结果全 部无效。

注意事项
选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药 敏试验，生长不良或陈旧菌株应传 代后再进行试验 比浊、菌液稀释应力求精确，以保 证接种菌量的准确。 下列操作应严格按技术规范进行， 防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、 菌液稀释和接种、烧灼接种环。
自制含药培养基

药物采购、药液制备、保存


基础培养基的制备
含药培养基的制备
WHO 推荐DST浓度
药物 Isoniazid Rifampicin Ethambutol Streptomycin Pyrazinamide Kanamycin Amikacin Capreomycin Ofloxacin Levofloxacin Moxifloxacin Gatifloxacin Ethionamide Prothionamide PAS Cycloserine LJ* 0.2 40.0 2.0 4.0 — 30.0 30.0 40.0 4.0 — — — 40.0 40.0 1.0 30.0