食品中三聚氰胺的检测方法

食品及饲料中三聚氰胺的检测方法
麻丽华
（江苏常州轻工职业技术学院，江苏常州213164）
摘要：近年来，在食品和饲料中频频出现三聚氰胺，给食品安全带来了威胁，对食品和饲料中三聚氰胺的检测已成为必须。

文章对国内外检测食品和饲料中三聚氰胺的分析方法进行了综述。

关键字：食品；饲料；三聚氰胺；检测
食品中三聚氰胺的检测方法
由于食品检测中测定蛋白质含量一般都是使用凯氏定氮法，这种方法其实是通过测定氮含量后，再根据蛋白质的含氮量（15%～17%）来折算成蛋白质含量，所以，当食品中添加了三聚氰胺，采用该法是不能测出其是否存在及含量的。

目前，国内外对检测三聚氰胺的方法报道较少，我国有国标方法———重量法、高效液相色谱法和电位滴定法，但这些方法均为针对化工产品中的常量三聚氰胺的测定，而食品及动物饲料中产品的基质复杂，用以上方法检测干扰因素多，不能得到准确结果。

国际上报道的测定三聚氰胺的方法，一般都是使用气相色谱法[2]、气相色谱—质谱法（GC—MS）[8]、液相色谱法（HPLC）[1-4-5-6]、液相色谱—质谱法[4]、酶联免疫吸附法（ELISA）[7]等来进行测定。

气相色谱—质谱法
方法原理：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液经离心后由混合型阳离子交换固相萃取柱净化，净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，O—双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，以气相色谱—质谱联用仪器进行定性和定量检测。

利用气相色谱法或气相色谱—质谱法测定时，需对试样进行衍生化，前处理比较复杂，一般检测一个样品需要4～5 h，前处理的效果对检测结果影响较大，检出限较高（] 5 mg/kg 或更高），仅能检测简单基质。

实验部分: 将三聚氰胺标准品和三聚氰酸标准品用二乙二乙胺乙腈水溶液为提取溶剂。

加入二乙胺有利于提高三聚氰胺和三聚氰酸的萃取率，加入乙腈有利于
沉淀水溶性蛋白，减少干扰。

实验发现，二乙胺!乙腈!水溶液可有效地沉淀牛
奶样品中的蛋白质和脂肪，提取和净化同时完成，滤液澄清，滤液吹干迅速，缩短了样品前处理时间.HP5MS毛细管色谱柱(30×0.25mm×0.25um）；进样口温度（250℃）脉冲不分流进样，脉冲压力275.8 KPa ；载气为高纯氦气（纯度为99.999％）流速1.3ml/min程序升温以75℃保持一分钟再以没30℃升一次温至
300℃再以50℃升温至315℃。

保持5.7分钟，全部程序时间14.5分钟。

进样，
进样量1uL.电子轰击（ EI）离子源；电子倍增器电压( 1306v)离能70eV离子
源温230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；全扫描（ SCAE）采集模式，扫描质量范围：m/z 40-450；溶剂延迟时间4.5/min 称取2.00g牛奶样品于15mL 刻度试管，加入7mL乙腈，振摇，加入1ml二乙胺，用水定容至10mL振摇，超声提取20min于4500r/min速率下离心10min过滤后备用。

移取1ml滤液置于样品瓶中，在75℃下通氮气缓缓吹干，加入200ul吡啶和200ul衍生化试剂，
用PTFE硅橡胶PTFE隔垫密封，微波8OOM加热反应, 5min冷却，供气相色谱质谱测定
结论本文建立的气相色谱B质谱测定牛奶中三聚氰胺和三聚氰酸含量具有特
异性强、前处理简单、重复性好等特点。

采用二乙胺B乙腈B水溶液提取牛奶
中三聚氰胺和三聚氰酸，无需净化，通过优化SIM条件有效地消除了复杂基体的干扰，节省了分析时间。

该方法简便、快速、准确，适合牛奶中三聚氰胺和三聚氰酸确证和定量测定。

[8]
液相色谱法
方法原理：
同气相—质谱法一样进行三聚氰胺提取、净化，将净化洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。

该法是目前检验食品及动物饲料中三聚氰胺含量的最为常用的方法，比较气相色谱—质谱法，该法不需要对样品进行衍生化，前处理相对简单，分析速度快。

实验部分
经二极管阵列检测器的波长扫描，三聚氰胺在215nm、236nm处均有特征吸收，但以215nm处最大，且杂质峰少，基线稳定，因此选择236nm作为检测波长。

因三聚氰胺结构中含有胺根，具有较强的极性，使其在反相键合相上保留值很低，接近于死时间流出，不能进行分析【2 J。

因此必须将一定量的离子对试剂加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对。

本文分别以磷酸二氢钾和辛烷磺酸钠为离子对试剂进行测定当用辛烷磺酸钠为离子对试剂时。

三聚氰胺在Symmetry C 。

柱上的保留值有明显提高，有效排除干扰峰的影响，因此选用辛烷磺酸钠作为离子对试剂。

分别移取1.Oml、2.Oml、5.Oml、lOml、50ml，超纯水定容至100ml容量瓶中，色谱进样量1Oul
结论
，三聚氰胺在1．0 mg／L一100 mg／L的浓度范围呈良好的线性内关系。

结合称样量和最终定容体积求得检出限为5mg／kg。

所以高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量，该法同国标所定的重量法相比，操作简便、灵敏、检测线性范围宽，具有较强的实用性.[4]
超高效液相色谱—电喷雾串联质谱法（UPLC—ESI—MS/MS)
原理：
本项研究工作采用超高效液相色谱（）进行分离，建立了饲料中三聚氰胺的超高效液相色谱!电喷雾串联质谱（）测定方法。

该方法具有快速、准确、灵敏等优点，适合于生产过程监控和出口把关检测的高灵敏度确证分析。

实验部分
首先采用1mg/l的三聚氰胺标准溶液以手动注射的方式在(正离子模式下进行母离子全扫描，确定三聚氰胺的分子离子EMS，与文献报道一致。

然后，以m/z127.1为母离子，对其子离子进行全扫描（见图!），上述质谱条件下，主要产生m/z109.1等子离子。

其中m/z109.1为脱m/z85为三聚氰胺开环分子重排失去H2NCN的碎片离子峰..M+H-H2NCN应为m/z 85.1脱去NH2的碎片离子
峰.M+H-H2NCN+NH3m/z60.2应为三聚氰胺开环分子重排失去的碎片离子峰
M+H-H2NCN。

选取丰度最强的子离子m/z85.1和68.2作为三聚氰胺的监测离子，最后以多反应监测正离子模式优化毛细管电压、锥孔电压、源温度、脱溶剂温度、碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数。

三聚氰胺以子离子85.1和68.2及二者的相对丰度比来定性，以子离子m/z 85.1为定量离子，峰面积外标法定量。

三聚氰胺是强极性化合物，在普通的"#$柱上保留值很低，接近于死时间流出，很难进行分析［%］。

为了增加三聚氰胺在"#$柱上的保留，必须选用洗脱能力非常弱的流动相，这是因为含水量越高的流动相其分析物与固定相之间的疏水作用越强，通常选用的流动相有水!甲醇、水!乙腈、醋酸铵缓冲液!甲醇、0.1％甲酸溶液!甲醇等。

由于三聚氰胺极易与C18柱上残余的硅醇基形成氢键，使得峰形拖尾，因此需要在流动相中加入辛烷磺酸钠TFHA等离子对试剂来改善峰形，也有研究报道在样品液或流动相中加酸可以增加柱对三聚氰胺的保留和改善峰形。

本研究发现三聚氰胺在"#$柱上的保留时间变化比较大，可能是流动相含水比例太高（＞90％）使得样品溶液中有机相比例的细微变化就能对保留时间造成比较大影响的缘故；同时发现，在流动相中加入离子对试剂或高浓度盐后离子抑制现象非常明显，这些因素都对三聚氰胺的定量和定性分析造成一定的干扰。

因此本研究选择对极性化合物有很好保留的ACQUITY BEH HILIC色谱柱进行分离，获得了稳定的保留时间；采用纯水与乙腈作为流动相梯度洗脱，获得了理想的峰形（见图"）。

研究结果表明，采用纯水与乙腈作为流动相时质谱信号最强，若在流动相中添加甲酸、乙酸或醋酸铵都会使信号降低，这可能是三聚氰胺极易电离，离子源中离子浓度过高会抑制三聚氰胺的电离，从而导致离子化效率下降的缘故。

与传统的HPLC分离方法比较，UPLC的分离使得分析时间大大缩短
结论
实验结果表明，本文建立的UPLC-ESI-MS方法具有特异性强、前处理简单、重复性好等特点，与传统的HPLC分离方法比较，分析时间大大缩短，定量下限为
10ug/kg该方法非常适合饲料中三聚氰胺的快速检测[5]
高效液相色谱—二极管阵列法（HPLC—DAD）
原理
目前国内外测定食品中三聚氰胺含量的方法很少, 一般采用气相- 质谱法[液相- 质谱法、液相色谱法[ 4, 5]等。

本试验避开毒性大的乙腈, 以甲醇和0. 02 m o l/L硫酸铵作为流动相, 甲醇提取样品, 吹干后20%的甲醇水溶解并定容, 进样, 用二极管阵列检测器检测, 结果令人满意
实验部分
取浓度为50 ug /mL的三聚氰胺标准使用液及某待检样品, 在200 ~ 400 nm波长处扫描, 发现三聚氰胺在200 ~220 nm处有强烈的吸收, 在234. 1 nm 处有吸收峰在235. 0处的吸收峰峰型对称, 存在的干扰少, 且流动相在低于210 nm 的波长下背景吸收较高, 故选用235. 0 nm 为检测波长。

样品中成分复杂, 可采用二极管阵列检测器对其进行光谱扫描, 并以保留时间和三维光谱图相似系数进行定性。

对不同流动相以及不同比例进行了多次试验。

结果发现用乙腈为流动相时, 乙腈正好在三聚氰胺出峰处有背景吸收, 很难分离, 且乙腈毒性大。

采用硫酸铵( 0. 02 m o l/L ) ；甲醇= 94 ：6( V /V ), 三聚氰胺与流动相甲醇的背景吸收完全分开, 且峰型对称, 出峰时间比较理想。

因为三聚氰胺有三个胺基, 易与金属离子络合, 采用106 g /L亚铁氰化钾2 mL和219 g /L醋酸锌沉淀蛋白质2 mL时, 三聚氰胺会有损失, 回收率仅为55%。

三聚氰胺是酰胺
类物质, 是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。

采用5%三氯乙酸沉淀蛋白质5 mL, 效果非常理想, 但时间不宜过长, 避免三聚氰胺包合于沉淀中, 降低提取率
结论
本试验方法利用次氯酸钠将食品中的甜蜜素转化为N,N2二氯环己胺,以正己烷萃取后用高效液相色谱法测定[10],待测组分能有效分离,样品测定的精密度、准确度较好,适用范围大,适用性强,便于在日常大批量检测中测定食品中甜蜜素的含量。

在本试验方法的基础上,只需调整甲醇和乙酸铵的比例,就可以做苯甲酸、山梨酸、糖精钠试验,适合于检测同时添加了苯甲酸、山梨酸、糖精钠、甜蜜素等添加剂的含乳饮料、果汁饮料等产品。

不需要使用气相色谱和液相色谱2种仪器,只需用液相色谱就可以了,避免了资源和能源的浪费[6]
酶联免疫吸附法（ELISA）
方法原理
利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。

将三聚
氰胺HRP 酶标记物、标样及样品提取液加入包被三聚氰胺抗体试验孔中孵育。

在30 min 的孵育过程中，样品中的三聚氰胺与HRP 酶标记物竞争结合三聚氰胺抗体。

孵育完后，倾去孔内液体，洗涤除去未结合的三聚氰胺和HRP 标记物。

每孔加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。

孵育20 min 后终止反应，读取各孔吸光度值。

比较未知样品的吸光度值与标样的吸光度值，就可计算出样品中的三聚氰胺浓度。

实验部分
将鸡蛋去壳后充分搅拌均匀袁取 5 g 置于 100 mL 离心管中渊空白样品按20
尧50尧100 ng/g 的浓度添加MA 标准品冤袁然后加入 50 mL 含 20%氨水的乙
腈袁剧烈振荡 10 min 后在4 000 r/min 下离心 15 min遥取 10 mL 上清液转移至干净分液漏斗中袁加入 10 mL 正己烷袁剧烈振荡 1 min袁静置分层遥收集下层乙腈相袁在 50 益水浴中旋转蒸干后复溶于1mL 的甲醇/水渊2颐8袁v/v 冤中袁用 0.45 滋m 的滤膜过滤后供ELISA 检测。

从不同超市尧农贸市场和养鸡场购得未知的鸡蛋 50枚袁按上述方法提取后进行ELISA检测。

结论与讨论
三聚氰胺做为一种工业用化学品袁长期食入可对人体造成严重危害遥虽然国家规定了 MA 在牛奶中的最高限量为 2.5 mg/kg袁但还没有发布其在其他动物性食品中的最高残留限量遥因此袁应该对其他动物性产品中的 MA 残留进行监控遥该研究建立的 ELISA 方法快速尧简便且灵敏袁能够对鸡蛋中的痕量 MA 残留进行检测袁通过添加回收率试验证明该方法准确可靠袁可以做为鸡蛋或其他动物性食品中MA残留的常规筛选方法[7]。

结束语
由于多起三聚氰胺被非法添加到食品和动物饲料中的事件发生，在食品和动物饲料检测中对其进行检测已成为必须。

因此，在对三聚氰胺的检测研究工作中，应重点关注建立适用的快速、准确、简便的检测方法及改进已有的检测方法，并将其推广，以保障食品安全。

参考文献
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三聚氰胺的含量[J]．宁夏石油化工，2005，（2）：24- 26．
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含量[J]．福建分析测试，2008，17（1）：57- 59．
[4] 李爱军，张代辉，马书民，等．液相色谱—串联质谱法测定
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[5] 蔡勤仁，欧阳颖瑜，钱振杰，等．超高效液相色谱—电喷雾
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测定高蛋白食品中的三聚氰胺[J]．食品与机械，2007，23
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[7] 汤慕瑾张恒郑晓燕吕敬章朱海陈昊翰酶联免疫吸附法快速
测定不同样品基质中三聚氰胺( 深圳出入境检验检疫局，广东深圳518067 )
2010 年第22 卷第4 期
[8] [李锋，姚伟琴，苏敏,李世雨,窦辉，尚德军，朱慧萍气相色谱-质谱法快速测定牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸 2009年3月]。