固态发酵食醋中有机酸HPLC分析方法的优化_余永建_邓晓阳_陆震鸣_史劲松_许正
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(1. School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou 646000, China; 3. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin, 300308, China)
Abstract: Quantitative determination of 9 organic acids in traditional Chinese vinegars by HPLC was optimized. The procedure of HPLC analysis was carried out on a reversed-phase C18 column, using sodium dihydrogen phoቤተ መጻሕፍቲ ባይዱphate as mobile phase. The flow rate was 0.9 mL/min and the detection wavelength was 210 nm. The HPLC analysis was completed within 14 min. The recovery rates of 9 organic acids were in the range of 96.02%-104.55% with RSD of 0.46%-3.52%. The limits of detection were 0.019-1.790 mg/L. This method is simple, accurate and suitable for the determination of organic acids in traditional Chinese vinegars. Key words: solid-state fermented vinegar; HPLC; organic acid
网络出版时间：2013-10-28 16:48 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20131028.1648.126.html
2013-10-24
固态发酵食醋中有机酸 HPLC 分析方法的优化
余永建 1，邓晓阳 1，陆震鸣 1,3，史劲松 1,2，许正宏 1,2,3,*
本文中用于 HPLC 分析条件优化的固态发酵醋样为镇江香醋，总酸 4.5 g/100 mL，主要生产原料为糯 米和麸皮，生产日期为 2012 年 4 月。
磷酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、硫酸锌（分析纯）、乙酸（分析纯）、 甲醇（色谱纯），中国医药（集团）上海化学试剂公司；草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、柠檬酸、 乳酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸均为色谱纯，Sigma-Aldrich（上海）公司。
关键词：固态发酵食醋；高效液相色谱（HPLC）；有机酸
Optimization of the analysis of organic acids in solid-state fermented vinegars by HPLC
YU Yong-jian1, DENG Xiao-yang1, LU Zhen-ming1,3, SHI Jin-song1,2, XU Zheng-hong1, 2,3,*
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2013-10-24
这些物质的存在容易导致食醋有机酸 HPLC 分析过程中柱压升高、使用寿命降低、有机酸分离度下降等问 题。本研究前期已对有机酸 HPLC 分析前的食醋样品预处理方法（沉淀、固相萃取）进行了优化[15]，本文 进一步对经过预处理后的醋样中 9 种有机酸的 HPLC 分析条件进行了优化及方法学评价，为固态发酵食醋 中有机酸定量分析及其酿造机理解析奠定了研究基础。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器
有机酸标准溶液（mg/mL）：草酸 0.50，酒石酸 1.00，丙酮酸 0.51，α-酮戊二酸 0.50，乳酸 4.02， 乙酸 10.05，柠檬酸 0.50，焦谷氨酸 0.50，琥珀酸 1.00。
实验室 pH 计，电子天平，Mettler Toledo 仪器（上海）有限公司；U3000 高效液相色谱，DIONEX 公 司；Sep-Pak C18 固相萃取小柱，美国 Waters 公司，500 mg/3 mL。 1.2 实验方法 1.2.1 食醋样品的预处理[15]
图 1 不同缓冲液浓度对保留时间的影响 Fig. 1 Effect of the concentration of buffer solution on retention time
磷酸盐缓冲溶液在紫外区几乎无吸收，是有机酸分析最常用的的流动相[17]。本研究中比较了 NaH2PO4、 KH2PO4、(NH4)2HPO4 缓冲液作为流动相（浓度 0.02 mol/L、pH 2.7、流速 0.7 mL/min、柱温 30℃）时，9 种有机酸的分离情况。结果表明，上述 3 种磷酸盐缓冲溶液对 9 种有机酸的出峰顺序和分离效果无显著性 差异。但是 NaH2PO4 缓冲液作为流动相时，有机酸的分析时间最短（＜17 min），而另外 2 种缓冲液则需 要 20 min 完成所有有机酸的分析，故选择 NaH2PO4 溶液为本实验的流动相。 2.3 流动相浓度的选择
基金项目：国家自然科学基金（31271922），国家 863 课题（2012AA021301, 2013AA102106），国家固态酿造工程技术中心 开放课题（2011B2211，GCKF201109）。 作者简介：余永建，男，博士研究生，研究方向为发酵工程。 *通讯作者：许正宏，教授，博导。E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn
不同浓度 NaH2PO4 溶液对各种有机酸保留时间及分离效果的影响见图 1。磷酸盐缓冲溶液的浓度高低 直接影响其缓冲容量的大小，影响酸在流动相中的存在形式及溶液的离子强度，从而影响色谱柱的分离效 果。缓冲溶液的浓度越高，待测有机酸的存在形式越稳定，但缓冲溶液的浓度不能过高，因为其浓度增高 时，离子强度也增大，对组分分离不利，同时影响泵和柱子的寿命，增加了流动相的本底吸收，降低了测 定的灵敏度[16]。本实验中：NaH2PO4 溶液浓度为 0.01 mol/L 时，α-酮戊二酸和乳酸不能分开，而流动相浓 度为 0.02、0.03 mol/L 时，有机酸均能得到有效分离（图 1）。考虑到高盐浓度对泵和柱子的不利影响，本 实验选用 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液作为流动相。
（1. 江南大学 药学院，江苏 无锡，214122； 2. 国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州，646000； 3. 中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津，300308）
摘要： 优化了固态发酵食醋中 9 种有机酸的高效液相色谱（HPLC）定量分析方法。色谱条件：以 C18 色 谱柱进行分离，流动相为 NaH2PO4 溶液，流速为 0.9 mL/min，检测波长为 210 nm，整个分析在 14 min 内 完成。在优化的色谱条件下，9 种有机酸的检测线性范围较宽，最低检出限为 0.02-1.79 mg/L，加标回收率 为 96.02%-104.55%，重复实验的相对标准偏差 0.46%-3.52%。该方法具有灵敏、准确、稳定等优点，可用 于固态发酵食醋中有机酸的测定。
目前用于食醋有机酸定量分析的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、离子排斥色谱法、毛细管电泳 法，气相色谱法[6-9]，其中 HPLC 由于具有高效快速、灵敏度高、稳定性好等优点使用最为普遍。已有学者 采用 HPLC 法对不同地域发酵食醋的有机酸组成进行了分析[10-12]，对食醋发酵过程中有机酸的变化规律进 行了研究[13, 14]。但是，目前对食醋中复杂有机酸组成的 HPLC 分析条件优化及其方法学评价的研究报道较 少。另外，食醋中除了富含有机酸以外，尚含有大量蛋白质等生物大分子物质，以及色素等小分子物质。
2
2013-10-24 2 结果与分析 2.1 检测波长的选择
本研究分别对 9 种有机酸在 190-400 nm 进行全波长扫描，发现各种有机酸在 210 nm 左右均有较大的 吸收，故采用 210 nm 作为醋样中 9 种有机酸的检测波长，此结果与赵景婵等人报道一致[16]。 2.2 流动相的选择
色谱柱：Waters Atlantis T3，5m，4.6150 mm； 检测波长：分别对 9 种有机酸的标准溶液进行全波长扫描（190-400 nm），确定样品的检测波长； 流动相：比较 3 种磷酸盐溶液（NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4）在不同浓度下（0.01，0.02，0.03 mol/L）， 用 H3PO4 调节不同 pH（2.3，2.5，2.7，2.9，3.1）时对食醋有机酸保留时间和分离度的影响； 柱温：25℃，30℃，35℃，40℃； 流速：0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/min； 进样量：10 μL。 1.2.3 HPLC 分析方法的验证 1.2.3.1 线性关系 取不同体积（0，0.1，0.2，0.5，2.0，4.0，6.0，8.0 mL）的有机酸标准溶液，用超纯水定容于 10 mL 容量瓶中，混匀后分别进行 HPLC 分析。绘制峰面积-浓度标准曲线，计算各有机酸的线性范围、回归方程 及相关系数，并以信噪比 S/N=3 对应的浓度确定各有机酸的检出限。 1.2.3.2 精密度 1 天内连续 6 次对同一有机酸标样进行 HPLC 分析，测定各有机酸的保留时间和峰面积，计算精密度 （以相对标准偏差 RSD 表示）。 1.2.3.3 准确度 取同一醋样 2 份（5.0 mL），其中 1 份作为本底，另 1 份加入有机酸标准溶液 5 mL，分别预处理后进 行 HPLC 分析，计算各有机酸的加标回收率。 1.2.3.4 重复性 取同一醋样 6 份（5.0 mL），分别预处理后进行 HPLC 分析，计算 RSD。 1.2.3.5 稳定性 取 5.0 mL 醋样进行预处理，分别在制样不同时间后（0，2，4，8，12，24 h）进行 HPLC 分析，计算 RSD。
取 5 mL 醋样于 100 mL 容量瓶中，加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液（10.6%）和 2 mL 硫酸锌溶液（30%）， 摇匀后用超纯水定容，静置 0.5 h 后用双层滤纸过滤，滤液用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，然后采用 Sep-Pak C18 固相萃取小柱处理（小柱用 5mL 甲醇进行活化，然后用 5 mL 超纯水平衡；将样品溶液缓慢流过小柱，流 速 1 mL/min），所得溶液用于 HPLC 分析。 1.2.2 HPLC 分析条件的优化
中国传统固态酿造食醋具有悠久的历史，是深受我国人民喜爱的一种调味品[1]。固态发酵食醋中有机 酸种类丰富，除乙酸外尚存在乳酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸等多种不挥发酸， 对食醋的口感具有重要影响[2]。例如，琥珀酸可增强醋的鲜味，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等可以缓 冲乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚[3]。食醋中有机酸主要来源于固态酿造过程中各种微生物的代谢 活动，且不同酿造原料（高粱、糯米、麸皮等多种谷物）和工艺生产的食醋中有机酸组成差别较大[4, 5]。 因此，准确测定食醋中有机酸的种类和含量，对于评价食醋品质及解析食醋酿造机理具有重要意义。
Abstract: Quantitative determination of 9 organic acids in traditional Chinese vinegars by HPLC was optimized. The procedure of HPLC analysis was carried out on a reversed-phase C18 column, using sodium dihydrogen phoቤተ መጻሕፍቲ ባይዱphate as mobile phase. The flow rate was 0.9 mL/min and the detection wavelength was 210 nm. The HPLC analysis was completed within 14 min. The recovery rates of 9 organic acids were in the range of 96.02%-104.55% with RSD of 0.46%-3.52%. The limits of detection were 0.019-1.790 mg/L. This method is simple, accurate and suitable for the determination of organic acids in traditional Chinese vinegars. Key words: solid-state fermented vinegar; HPLC; organic acid
网络出版时间：2013-10-28 16:48 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20131028.1648.126.html
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固态发酵食醋中有机酸 HPLC 分析方法的优化
余永建 1，邓晓阳 1，陆震鸣 1,3，史劲松 1,2，许正宏 1,2,3,*
本文中用于 HPLC 分析条件优化的固态发酵醋样为镇江香醋，总酸 4.5 g/100 mL，主要生产原料为糯 米和麸皮，生产日期为 2012 年 4 月。
磷酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、硫酸锌（分析纯）、乙酸（分析纯）、 甲醇（色谱纯），中国医药（集团）上海化学试剂公司；草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、柠檬酸、 乳酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸均为色谱纯，Sigma-Aldrich（上海）公司。
关键词：固态发酵食醋；高效液相色谱（HPLC）；有机酸
Optimization of the analysis of organic acids in solid-state fermented vinegars by HPLC
YU Yong-jian1, DENG Xiao-yang1, LU Zhen-ming1,3, SHI Jin-song1,2, XU Zheng-hong1, 2,3,*
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这些物质的存在容易导致食醋有机酸 HPLC 分析过程中柱压升高、使用寿命降低、有机酸分离度下降等问 题。本研究前期已对有机酸 HPLC 分析前的食醋样品预处理方法（沉淀、固相萃取）进行了优化[15]，本文 进一步对经过预处理后的醋样中 9 种有机酸的 HPLC 分析条件进行了优化及方法学评价，为固态发酵食醋 中有机酸定量分析及其酿造机理解析奠定了研究基础。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器
有机酸标准溶液（mg/mL）：草酸 0.50，酒石酸 1.00，丙酮酸 0.51，α-酮戊二酸 0.50，乳酸 4.02， 乙酸 10.05，柠檬酸 0.50，焦谷氨酸 0.50，琥珀酸 1.00。
实验室 pH 计，电子天平，Mettler Toledo 仪器（上海）有限公司；U3000 高效液相色谱，DIONEX 公 司；Sep-Pak C18 固相萃取小柱，美国 Waters 公司，500 mg/3 mL。 1.2 实验方法 1.2.1 食醋样品的预处理[15]
图 1 不同缓冲液浓度对保留时间的影响 Fig. 1 Effect of the concentration of buffer solution on retention time
磷酸盐缓冲溶液在紫外区几乎无吸收，是有机酸分析最常用的的流动相[17]。本研究中比较了 NaH2PO4、 KH2PO4、(NH4)2HPO4 缓冲液作为流动相（浓度 0.02 mol/L、pH 2.7、流速 0.7 mL/min、柱温 30℃）时，9 种有机酸的分离情况。结果表明，上述 3 种磷酸盐缓冲溶液对 9 种有机酸的出峰顺序和分离效果无显著性 差异。但是 NaH2PO4 缓冲液作为流动相时，有机酸的分析时间最短（＜17 min），而另外 2 种缓冲液则需 要 20 min 完成所有有机酸的分析，故选择 NaH2PO4 溶液为本实验的流动相。 2.3 流动相浓度的选择
基金项目：国家自然科学基金（31271922），国家 863 课题（2012AA021301, 2013AA102106），国家固态酿造工程技术中心 开放课题（2011B2211，GCKF201109）。 作者简介：余永建，男，博士研究生，研究方向为发酵工程。 *通讯作者：许正宏，教授，博导。E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn
不同浓度 NaH2PO4 溶液对各种有机酸保留时间及分离效果的影响见图 1。磷酸盐缓冲溶液的浓度高低 直接影响其缓冲容量的大小，影响酸在流动相中的存在形式及溶液的离子强度，从而影响色谱柱的分离效 果。缓冲溶液的浓度越高，待测有机酸的存在形式越稳定，但缓冲溶液的浓度不能过高，因为其浓度增高 时，离子强度也增大，对组分分离不利，同时影响泵和柱子的寿命，增加了流动相的本底吸收，降低了测 定的灵敏度[16]。本实验中：NaH2PO4 溶液浓度为 0.01 mol/L 时，α-酮戊二酸和乳酸不能分开，而流动相浓 度为 0.02、0.03 mol/L 时，有机酸均能得到有效分离（图 1）。考虑到高盐浓度对泵和柱子的不利影响，本 实验选用 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液作为流动相。
（1. 江南大学 药学院，江苏 无锡，214122； 2. 国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州，646000； 3. 中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津，300308）
摘要： 优化了固态发酵食醋中 9 种有机酸的高效液相色谱（HPLC）定量分析方法。色谱条件：以 C18 色 谱柱进行分离，流动相为 NaH2PO4 溶液，流速为 0.9 mL/min，检测波长为 210 nm，整个分析在 14 min 内 完成。在优化的色谱条件下，9 种有机酸的检测线性范围较宽，最低检出限为 0.02-1.79 mg/L，加标回收率 为 96.02%-104.55%，重复实验的相对标准偏差 0.46%-3.52%。该方法具有灵敏、准确、稳定等优点，可用 于固态发酵食醋中有机酸的测定。
目前用于食醋有机酸定量分析的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、离子排斥色谱法、毛细管电泳 法，气相色谱法[6-9]，其中 HPLC 由于具有高效快速、灵敏度高、稳定性好等优点使用最为普遍。已有学者 采用 HPLC 法对不同地域发酵食醋的有机酸组成进行了分析[10-12]，对食醋发酵过程中有机酸的变化规律进 行了研究[13, 14]。但是，目前对食醋中复杂有机酸组成的 HPLC 分析条件优化及其方法学评价的研究报道较 少。另外，食醋中除了富含有机酸以外，尚含有大量蛋白质等生物大分子物质，以及色素等小分子物质。
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2013-10-24 2 结果与分析 2.1 检测波长的选择
本研究分别对 9 种有机酸在 190-400 nm 进行全波长扫描，发现各种有机酸在 210 nm 左右均有较大的 吸收，故采用 210 nm 作为醋样中 9 种有机酸的检测波长，此结果与赵景婵等人报道一致[16]。 2.2 流动相的选择
色谱柱：Waters Atlantis T3，5m，4.6150 mm； 检测波长：分别对 9 种有机酸的标准溶液进行全波长扫描（190-400 nm），确定样品的检测波长； 流动相：比较 3 种磷酸盐溶液（NaH2PO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4）在不同浓度下（0.01，0.02，0.03 mol/L）， 用 H3PO4 调节不同 pH（2.3，2.5，2.7，2.9，3.1）时对食醋有机酸保留时间和分离度的影响； 柱温：25℃，30℃，35℃，40℃； 流速：0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/min； 进样量：10 μL。 1.2.3 HPLC 分析方法的验证 1.2.3.1 线性关系 取不同体积（0，0.1，0.2，0.5，2.0，4.0，6.0，8.0 mL）的有机酸标准溶液，用超纯水定容于 10 mL 容量瓶中，混匀后分别进行 HPLC 分析。绘制峰面积-浓度标准曲线，计算各有机酸的线性范围、回归方程 及相关系数，并以信噪比 S/N=3 对应的浓度确定各有机酸的检出限。 1.2.3.2 精密度 1 天内连续 6 次对同一有机酸标样进行 HPLC 分析，测定各有机酸的保留时间和峰面积，计算精密度 （以相对标准偏差 RSD 表示）。 1.2.3.3 准确度 取同一醋样 2 份（5.0 mL），其中 1 份作为本底，另 1 份加入有机酸标准溶液 5 mL，分别预处理后进 行 HPLC 分析，计算各有机酸的加标回收率。 1.2.3.4 重复性 取同一醋样 6 份（5.0 mL），分别预处理后进行 HPLC 分析，计算 RSD。 1.2.3.5 稳定性 取 5.0 mL 醋样进行预处理，分别在制样不同时间后（0，2，4，8，12，24 h）进行 HPLC 分析，计算 RSD。
取 5 mL 醋样于 100 mL 容量瓶中，加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液（10.6%）和 2 mL 硫酸锌溶液（30%）， 摇匀后用超纯水定容，静置 0.5 h 后用双层滤纸过滤，滤液用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，然后采用 Sep-Pak C18 固相萃取小柱处理（小柱用 5mL 甲醇进行活化，然后用 5 mL 超纯水平衡；将样品溶液缓慢流过小柱，流 速 1 mL/min），所得溶液用于 HPLC 分析。 1.2.2 HPLC 分析条件的优化
中国传统固态酿造食醋具有悠久的历史，是深受我国人民喜爱的一种调味品[1]。固态发酵食醋中有机 酸种类丰富，除乙酸外尚存在乳酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸等多种不挥发酸， 对食醋的口感具有重要影响[2]。例如，琥珀酸可增强醋的鲜味，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等可以缓 冲乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚[3]。食醋中有机酸主要来源于固态酿造过程中各种微生物的代谢 活动，且不同酿造原料（高粱、糯米、麸皮等多种谷物）和工艺生产的食醋中有机酸组成差别较大[4, 5]。 因此，准确测定食醋中有机酸的种类和含量，对于评价食醋品质及解析食醋酿造机理具有重要意义。