重要观赏兰科植物的分子生物学研究进展

植物学通报 2004, 21 (4): 471￣477

Chinese Bulletin of Botany

专题介绍

重要观赏兰科植物的分子生物学研究进展①

１，２朱根发② ２郭振飞

１（广东省农业科学院花卉研究所 广州 ５１０６４０） ２（华南农业大学生命科学院 广州 ５１０６４０）

摘要 兰科植物是开花植物中最大的家族之一，分子标记技术应用于兰科植物的分类鉴定和品种鉴别，为兰花的分类提供了分子水平的证据，也为兰花保护策略和措施的制定提供了理论基础。兰科植物表现有高度特异的形态、结构和生理特性，是研究花着色机理和子房发育的理想对象。兰花离体培养开花系统的建立，可以用来探明兰花从营养生长向生殖生长的转变机制，是研究花的分化和发育的理想材料。兰花具有特异的查尔酮合成酶（ＣＨＳ）基因和二氢叶酸还原酶（ＤＦＲ）基因等控制花色素的合成，ＤＯＨ１基因控制石斛兰花芽的形成和提早开花，ＰＨＡＬ．０３９基因和ＡＣＣ合成酶基因在蝴蝶兰授粉后的子房发育中起着重要的调控作用，这些特异基因的分离和克隆为兰花花的分化、发育及着色机制提供了分子基础。蝴蝶兰属、大花蕙兰（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ　ｈｙｂｒｉｄｉｕｍ）、石斛兰属、文心兰属、五唇兰属和万代兰属等兰科植物都有转基因的研究报道，主要以原球茎为材料采用基因枪或农杆菌法转化，部分研究获得了转化植株。

关键词 兰科植物，分子标记，基因克隆，转基因，花的发育，分子生物学

Progress on Molecular Biology of Main

Ornamental Orchidaceae

１，２　ＺＨＵ　Ｇｅｎ－Ｆａ② ２　ＧＵＯ　Ｚｈｅｎ－Ｆｅｉ

１（Ｆｌｏｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６４０）２（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６４０）

Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅｓｔ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔｓ．　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔａｘｏｎｏｍｙ，　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｒ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ．　Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ　ｈａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｉｔ　ｉｓ　ａｎ　ｉｄｅａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｆｌｏｗｅｒ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｖｕｌｅ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｏｒｃｈｉｄｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｐａｔｈｗａｙ　ｗａｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＣＨＳ　ａｎｄ　ＤＦＲ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｏｒｃｈｉｄｓ．Ｆｌｏｗｅｒ　ｂｕｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅａｒｌｙ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｙ　ＤＯＨ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ．　ＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＰＨＡＬ．０３９　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｍｏｓｔ　ｌｉｋｅｌｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｏｖｕｌｅ　ｔｉｓｓｕｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｉｎ　Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓｓｐｐ．，　Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ．，　Ｏｎｃｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ．，　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｓｐｐ．，　Ｄｏｒｉｔｉｓ　ｓｐｐ．，　ａｎｄ　Ｖａｎｄａ　ｓｐｐ　．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ　ｂｙ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｏｒ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．

①广东省科技攻关重大专项（２００３Ａ２０１０４０）和广东省农业科学院院长基金（２００１－基金－２４）。

②通讯作者。Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｈｕｇｆ＠１６３．ｎｅｔ

收稿日期：２００３－０３－３１ 接受日期：２００３－１０－２７ 责任编辑：孙冬花

４７２２１（４）

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓＯｒｃｈｉｄａｃｅａｅ，　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ，　Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅ，　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　Ｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ

兰科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）植物是开花植物中最大的家族之一，有６个亚科７２５属约２５　０００多个种（Ｆｌｏｙｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。广泛分布于各种生态环境，并表现有高度特异的形态、结构和生理特性。这些高度特异的叶形、花形和花色正是人们欣赏兰花及热爱兰花的根本原因。对兰花育种、组织培养、生理、栽培和分子生物学等的研究，是花卉学研究的热点之一。本文就兰花分子生物学研究的进展进行综述。

１ 分子标记技术在兰花分类鉴定上的应用

分子标记技术近十年来取得了重大的发展，已构建了水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ　Ｌ．）、玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）和大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）等十几种重要农作物的分子标记连锁图谱。利用分子标记技术，不仅可以绘制品种的指纹图谱及目标性状的基因连锁图，还可以用来研究种质资源的遗传多样性，进行种质资源的创新和鉴定（贾继增，１９９６；张德水和陈受宜，１９９８）。在育种上，利用分子标记技术将使亲本的选配更准确且更快速，从而提高育种效率，也可以及时准确地鉴定Ｆ１的真实性，并预测杂种优势。在回交育种中，利用分子标记辅助选择（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，　ＭＡＳ），不仅可以提高选择效率，而且可有效地用于数量性状的遗传改良（张德水和陈受宜，１９９８；陈升和张启发，２０００）。

用于植物种质资源鉴定和育种的分子标记技术，主要有限制性片断长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃ－ｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，　ＲＦＬＰ）、随机扩增多态性（ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，　ＲＡＰＤ）、简单重复序列（ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，　ＳＳＲ）和扩增片断长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，　ＡＦＬＰ）等。比较而言，ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ技术在主要农作物和园艺作物上的研究和应用较多，ＡＦＬＰ和ＳＳＲ则较少（许占友和常汝镇，２０００）。但一些研究表明，ＡＦＬＰ标记每一引物组合检出的多态性带数最多，重复性好，作全基因组背景选择有明显的优势，适用于研究不同种质间的遗传关系以及亲子间的系谱分析等（许占友和常汝镇，２０００；陈升和张启发，２０００；祝军等，２０００）。

分子标记技术用于兰花分类鉴定和亲缘关系分析上，国内外已有一些报道。Ｃｈｏｉ等（１９９８）在杂交中发现春兰（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ　ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ）与建兰（Ｃ．　ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍ）、寒兰（Ｃ．　ｋａｎｒａｎ）和墨兰（Ｃ．　ｓｉｎｅｎｓｅ）具较高的亲和性；而与蕙兰（Ｃ．　ｆａｂｅｒｉ）、纹瓣兰（Ｃ．　ａｌｏｉｆｏｌｉｕｍ）、鼓槌石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｕｍ）和蝴蝶兰杂交则无亲和性，经ＲＡＰＤ分析发现，春兰与建兰、寒兰和墨兰的亲缘关系较近，与蕙兰和纹瓣兰亲缘较远，与石斛兰和蝴蝶兰更远。文李等（２００１）利用ＲＡＰＤ技术分析了兰属５个种２个变种共１３个品种间的亲缘关系，从５５种１０个碱基随机引物中筛选出４种引物，扩增出９３条多态性带，多态率为１００％，通过聚类分析表明，建兰、墨兰和春兰的亲缘关系较近，而春剑（Ｃ．　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、寒兰、独占春（Ｃ．ｅｂｕｒｎｅｕｍ）和兔耳兰（Ｃ．　ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ）与建兰的亲缘关系较远。

丁小余等（２００２）对束花石斛（Ｄ．　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｕｍ）与同属相似种玫瑰石斛（Ｄ．　ｃｒｅｐｉｄａｔｕｍ）、喇叭唇石斛（Ｄ．　ｌｉｔｕｉｆｌｏｒｕｍ）、报春石斛（Ｄ．　ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ）和兜唇石斛（Ｄ．　ａｐｈｙｌｌｕｍ）进行了ｒＤＮＡ　ＩＴＳ区序列比较研究，发现尽管束花石斛及其相似种的外部形态差异较小，但在ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列上