绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用

一、GFP的结构
图2 绿色荧光蛋白结构

GFP编码238个氨基酸的多肽单体，只有完整的GFP 分子 才会产生生物荧光，被切断的GFP(即使是C、N 末端的少 数几个氨基酸)亦能导致GFP 失去发光能力[6]。与荧光 的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团 (Chromophore)的部位[7]。在GFP 的初级氨基酸序列 上，第65～67 个氨基酸(Ser-Tyr-Gty) 形成环状三肽， 以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受 种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过 自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定, 不易变性, 用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是 当pH 值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢 复到变性前的水平。GFP 的生色团之间是通过共价键结 合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在 的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽， 这可能是形成色基的必然过程。[8]
5 计算细胞生长速度

在高水平组合型表达GFP 的细胞品系中, 在细胞 生长的对数期, 绿色荧光蛋白所发出的荧光信号 与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度 都可以相应地转变成细胞浓度。尽管在细胞生长 的后期, 用荧光信号计算得到的细胞数目略低于 培养物中的实际数目。但在常用的台盼蓝计数方 法中, 这个误差是允许的。利用这一技术, 可以测 定某些细胞的分布和生长状况, 尤其是一些透明 的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、 分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体 内的生长、扩散情况的研究, 取得了不错的效果。
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2 荧光稳定

GFP无光漂白现象，在很大的pH 范围内(pH7～ 12)都可以正常发出荧光，受温度的影响也很小， 只有在超过65℃时才会变性，荧光消失。荧光显 微镜强光照射下，GFP抗光漂白 (Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein) 强[9]。特别在450～490 nm蓝光波长下更稳定, 但在340～390 nm或395～440 nm范围内，仍 会发生光漂白现象。对于长时间光照，GFP也有 很好的耐受性，根据Sheen 等的研究，GFP在受 体内表达时可以持续得到不低于10分钟的荧光。
二、GFP 的应用特点


1 易于检测 GFP荧光反应不需外加任何反应底物，酶或其它共反应因 子, 也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需 紫外光或蓝光激发, 即可发出绿色荧光，GFP发射的荧光 用肉眼或荧光显微镜就可以检测到。灵敏度高, 对于单细 胞水平的表达也可识别, 同时还可利用其进行定量检测。 由于GFP 对活细胞基本无毒害, 因此无须特殊处理就可以 很方便地进行活体观察。而且，具有不同光谱特性的GFP 突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或 启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析 诊断等研究。这就使GFP有可能成为一种快速、简便、经 济的标记蛋白，GFP基因作为报道基因可能有广泛的用途。
3 细胞亚结构及蛋白质分子的定位

对于许多蛋白质来说，易位是它们激活机制中的一部分。 以前多是用细胞分级分离和免疫细胞化学的技术进行研究， 而现在利用GFP融合蛋白的显像技术无疑是一种简便而可 靠的检测方法，我们不仅可以更快地而且可以更全面地对 蛋白质的移动进行研究。近几年,在GFP技术的进步中最 重要的就是对几个GFP突变体的鉴定。通过标准的荧光显 微镜，根据它们所发出的不同颜色的荧光，就可以在活细 胞中同时而准确的区分多种不同的荧光融合蛋白以及了解 它们的分布情况[17]。在实际中，常用蓝绿色荧光蛋白 (CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)两种突变体的组合来在活细 胞中进行双色显示。而其他的突变体如蓝色荧光蛋白 (BFP)和红色荧光蛋白(RFP)的使用还受到许多限制，因 为它们有很快的光漂白作用或者是发射的荧光强度太低。 最近又发现GFP 是一个良好的细胞间信号传递的动态标 记分子, 可以跟踪观测第二信使, 如Ca2+和cAMP 水平的 起伏变化, 细胞间隙pH 值的变化等[18]。

图1 绿色荧光蛋白

1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先从一种水母 类动物Aequorea Victoria中分离纯化出了GFP, 1992年 Prasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一 级结构,1994年M.Chalfie[3]等最早用重组野生GFP型基 因做报告基因, 成功地在原核和真核生物中得到表达。90 年代后, 人们对GFP的性质和应用进行了不断深入的研究, 有关GFP 及其利用的研究进展较快，现在它已经发展成 了现代生物学研究的一个精确工具。目前在细胞生物学、 植物学、动物学、微生物学等学科研究中都有着相当广泛 的应用。随着人们对GFP发光机制研究的深入, 通过对其 发光团区域和其它区域进行随机诱变, 已经得到了许多 GFP突变型, 有的发蓝光或黄光而不是绿光[4]；有的发出 的荧光比野生型的强很多, 激发后很容易用肉眼观察到； 有的则是温度突变型, 其表达不受温度的限制[5]；有的突 变体则可以特异地在某些物种中高效表达。这些突变体极 大地拓宽了GFP的应用范围, 使GFP在细胞生物学和分子 生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前景。
6.观察细胞内酶的活动

GFP突变子不仅仅可以用来探测融合蛋白的空间 定位，而且可以对活细胞的酶活动，如：磷酸化 作用、蛋白水解作用等进行报告，还可以测量与 酶活动相关的细胞内的pH、cAMP、Ca2+浓度。 通过将外源序列插人GFP基因中，可以对细胞内 酶的活动进行观察以及了解这些酶的生理学参数。 插入外源基因后所表达的融合蛋白中的GFP蛋白 发色基团会发生构像改变，其发射的荧光的强度 也会发生很大的变化。这些指示剂可以用来检测 细胞内许多酶的作用，例如：蛋白水解酶、激酶、 氧化还原酶以及一些小配基的浓度[20]。
2 细胞筛选

基于GFP能够吸收、发射光，并且荧光稳定以及检测方法 快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。譬如应 用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等 [14]使用GFP 作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下， 仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外，研究发现 通过GFP 荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡 [15]。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记，通 过筛选已经获得GFP表达的E.coli、人体肾细胞和猿猴 COS- 1细胞等特殊类型。Sheen J 等在GFP转染玉米原 生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色 荧光，约占细胞总数66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧 光，荧光强度是对照的74 倍[16]。因此，用流式细胞计 数仪或荧光活化细胞计数仪( FACS) 很容易将两类细胞分 离开来。
5 无毒害

Chalfie等的研究表明：GFP对生活细胞基 本无毒害，Sheen等(1995)的研究进一步 表明：在玉米中，即便GFP在细胞中的表达 量很高时，对细胞也不会产生明显毒害。 但是至今我们还不太了解它对植物再生能 力的影响。
三、GFP在细胞生物学研究中的应用

1 对细胞生理过程的监控 在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突 变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这 些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目 前GFP融合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转 移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。 Shen[10]等在培养的神经元中发现，细胞内的Ca2+瞬间变化就会 引起GFP标记的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaM KⅡ)可逆地易位到突触后膜的 densities上。Shi[11]等用GFP标记来监控α-氨基羟甲基恶唑丙酸 (AMPA)的受体，发现它会从细胞内膜转移到树突棘的表面，根据突 触中AMPA受体的含量可以解释突触沉默、活化的原因和机制。 Siegel[12〕等将野生型的GFP插人Shake K十通道的特殊部位，形 成一个异源嵌合体，这个嵌合体发出的荧光将会随着细胞的去极化作 用而缓慢的减少。相反，Yanagawa[13]等将β-内酰胺酶插人GFP得 到了一个融合体，当此融合体与β-内酰胺酶抑制肽(BLIP)结合时,它 的荧光发射量会大大增加。
7 用于细胞示踪实验研究


利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵 袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以 往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗 原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操 作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行 示踪。 李侠【21】等将携有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pEGFP-N3质粒体 外转染C6胶质瘤细胞，筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆，以立体定向 法植入SD大鼠脑实质内建立大鼠移植瘤模型。4周后处死大鼠并作鼠脑连续 石蜡切片,相邻的切片分别做苏木素-伊红(HE)或免疫组化染色后荧光显微镜 下检测。在荧光显微镜很容易区分肿瘤区和非肿瘤区，并能发现侵袭至远处 的单个肿瘤细胞，其敏感性和特异性明显优于HE染色和免疫组化方法。朱君 明[22]等将GFP和HTH1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH1-SN转 染NIH-3 T3细胞，且移植人Parkinon病模型大鼠纹状体内后，也清晰地观 察到了NIH-3 T3细胞在脑内的生长情况。Xin[23]等将EGFP转人EG4细胞 (一种原胚细胞)中，建立了几株既可以表达绿色荧光蛋白又依然保持了多能 干细胞特征的EG4-GFP细胞系，通过对聚集的EG4-GFP细胞到8细胞胚胎的 研究,可以追踪到EG4-GFP细胞在体外分化情况以及在胚胎发育中的命运。
4 用于细胞内蛋白质的动力学研究


研究细胞内蛋白质相互作用的技术主要有两种：光漂白荧光恢复法 (FRAP)、光漂白荧光损失法(FLIP)。FRAP主要是通过对细胞内特定 的点或区域进行强烈的光照，使荧光发生光漂白作用，再通过相同时 间间隔的光影像采样记录下荧光恢复的动力学过程。FRAP不仅可以 确定细胞器上的蛋白，还可以确定流动蛋白的滞留时间。转录、mRNA前体的剪切、DNA的修复中蛋白质复合体操作机制都可以用这种 方法来研究。FLIP是对细胞的一个区域进行持续性的光漂白，再对光 漂白区外的荧光的损失进行监控就可以获得一些标记蛋白之间的相关 性信息。目前正在体外通过改变光照点的大小和固定细胞来研究光漂 白作用的可逆性，不过还是与活细胞的环境有一定的差距。 另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光 光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一 定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正 计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小 和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数[19]。
绿色荧光蛋白(GFP )技术在 细胞生物学研究中的应用

荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞 亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可 以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母 类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学 上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫 外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、 底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或 组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应 不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一 性, 检测简单， 结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白 (Reporter protein) 。可广泛用于基因的表达与调控、 蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。
3 广谱性

首先表现在它的表达几乎不受种属范围的 限制，在微生物、植物、动物中都获得了 成功的表达；其次就是没有细胞种类和位 置的限制，在各个部位都可以表达，发出 荧光。
4 易于载体构建

由于GFP 较小，只含有238 个氨基酸，编 码GFP 的基因序列也较短，约2.6kb，所 以它可以很方便地同其它序列一起构建多 种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频 率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中 表达很弱，但可通过更换GFP生色团氨基酸、 改变碱基组分、除去内含子、更换强启动 子等方法加强表达。Connack 等筛选出了 三种含Ser65 突变的突变体，在大肠杆菌 中表达时，荧光强度比野生型高约100倍。