高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法

课堂报告名称：高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法
一、课堂报告依据的知识背景
1. 培养基及其分类
人类想要研究利用微生物，就必须先培养微生物。

培养微生
物要有适合微生物生长繁殖的环境条件，还要适宜的营养条
件。

由人工配置的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营
养基质，称作培养基。

◆按用途分类：增殖培养基；选择培养基；鉴别培养基。

◆按状态分类：液体培养基；固体培养基；半固体培养基。

◆按化学成分分类：天然培养基；合成培养基；半合成培养基。

◆按目的分类：种子培养基；发酵培养基。

1）. 培养基包含成分
a)水：水分是微生物重要组成部分，微生物不能脱离水而生
存，微生物所需的营养也只有溶于水才能很好地吸收，水
利于调节细胞温度，保持细胞生活环境的温度恒定。

水分
为两种状态，自由水和结合水。

前者以游离态存在，是细
胞内的溶剂；后者与细胞内其他成分结合，不易蒸发，不
冻结，不渗透，也不能作为溶剂。

b)碳源：提供为生物细胞组成和代谢产物中碳素来源的物质。

提供微生物生长繁殖所需的能量。

碳源分类很多，无机碳化合物有二氧化碳、碳酸盐等；有
机含碳化合物，如糖类、醇类、有机酸、蛋白质及其分解
产物。

c)氮源：可提供为生物细胞组成和代谢产物中氮素来源的物
质。

氮源用来合成氨基酸和碱基进而合成蛋白质、核酸等
细胞成分以及含氮代谢产物。

氮源分类：
1.分子态氮，存在大气中，仅有少数微生物可以利用；
2.无机态氮，如铵盐、硝酸盐等，多数微生物可以利用；
3.有机态氮，蛋白质及各种分解产物、尿素、嘌呤碱、
嘧啶碱等。

d)能源：提供微生物生命活动过程中所需的能量来源的物质。

异养微生物能源为碳源；自养微生物能源是日光。

e)生长因子：微生物不能自行合成，但生命活动又不可缺少
的微量有机营养物质。

功能：构成细胞的组成成分，如嘌呤、嘧啶是核酸的组成
成分；调节代谢，维持正常的生命活动。

自养微生物不需要生长因子，能自行合成；异养微生物有三
种情况：有些异养微生物需要生长因子，如谷氨酸的短杆菌，
需要添加生物素才能使菌体生长良好；有些不需要生长因子；
有些不但不需要还能在自身积累某些维生素，如肠道微生物
分泌大量维生素供机体吸收利用，大肠杆菌合成维生素K。

f)无机盐类：微生物生长过程中不可缺少的营养物质。

从量
的角度分主要元素和微量元素两大类。

前者指磷钠硫钙镁铁等；后者锌锰钼钴等。

作用：构成细胞组成成分，磷是核酸的组成元素之一；做酶的组成成分或酶的激活剂，铁是过氧化氢酶细胞色素氧化酶的组成成分，钙是蛋白酶激活剂；调节微生物的生长的物理条件，渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等；作为某些自养微生物的能源，如硫细菌以硫作为能源。

g)碳氮比：是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比，适
当的碳氮比例，有助于微生物发酵分解。

碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，过低导致菌体提早自溶；过高导致细菌代谢不平衡，最终不利于产物的积累。

即使碳氮比处在合适水平，碳源和氮源浓度过高和过低也不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，浓度过高，细胞在发酵过程后期生长缓慢，代谢废物产生较多，最终使得菌体代谢异常，影响外源蛋白合成；浓度过低，培养基所能提供的营养物质有限，影响细胞的繁殖。

因此培养基除了氮源碳源浓度适宜，还需要二者比例关系确定。

h)PH值：各类微生物生长的PH值不尽相同，环境中的pH值
对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给
性以及有害物质的毒性。

每种微生物都有其最适pH值和
一定的pH范围。

在最适范围内酶活性最高，如果其他条
件适合，微生物的生长速率也最高。

大多数细菌、藻类和
原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH 4-10之间也可以生
长；放线菌一般在微碱性即pH7.5-8最适合；酵母菌、霉
菌则适合于pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10
之间。

有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。

i)渗透压：恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶
液移向浓度较高的溶液的在较高浓度溶液的液面上施加
的额外压强称为渗透压。

培养基内物质浓度要合适。

j)氧化还原电位：一般，好氧微生物在氧化还原电位为正时都能生长，而厌氧微生物要求氧化还原电位为负值，其中
严格厌氧微生物要求氧化还原电位在-400mV以下
2）.培养基配制的基本原则
a.要确定研究目的，明确微生物的营养类型，同时应该了解微生物
的类群、生活环境；
b.应当查阅大量文献，总结借鉴前人工作经验；
c.具体问题具体分析，本着既要满足微生物的生长繁殖或积累大量
代谢产物
d.要求，同时又要降低成本的原则，通常从培养基成分考虑，以配
制生长繁殖所需的培养基。

二、撰写课堂报告的目的
1.了解微生物营养与生长的相关知识；
2.了解培养基成分、类型；
3.熟悉高产油脂微生物的种类；
4.学会用培养基培养筛选需要的菌株；
5.学会优化培养基发酵条件。

三、撰写课堂报告的思路
通过对微生物营养与生长相关知识的学习掌握，围绕高产油脂菌株培养基优化与培养条件优化这一研究问题，通过对高产油脂菌株的特点进行分析，寻找培养基优化和培养条件优化最佳方法，初步构建高产油脂菌株的培养基与培养条件优化的方法体系。

四、课堂报告的正文
1.产油脂微生物
1)微生物油脂
又称单细胞油脂，是酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，以碳水化合物和普通油脂为碳源，在菌体内产生油脂。

2)常见产油微生物种类
能生产油脂的微生物有酵母菌、霉菌、细菌和藻类等。

其中真核的酵母菌、霉菌和藻类等能够合成与植物油组成类似的甘油三酯，而原核的细菌则合成特殊的脂类。

目前研究的较多的是酵母菌、霉菌和藻类。

现在用生产多不饱和脂肪酸的为真菌、细菌和藻类，由于细菌
产量低，目前主要集中在真菌和藻类。

微生物生产油脂不仅具有油脂含量高、生产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点；而且可用细胞融合、细胞诱变等方法，使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如EPA、DHA、类可可脂等
3）微生物油脂的产油机理
微生物产乍油脂的过程本质上与动植物产生油脂的过程相似，都是从利用乙酰 CoA羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长及经去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程。

4）高产油脂菌株生物量与油脂测定方法
（1）菌体生物量测定：湿菌体于60℃烘至恒重，以g干菌体，L发酵液表示菌体生物量。

（2）油脂测定方法：提油前菌体的处理采用酸热法破碎细胞，即在菌体中加入4mol／L的盐酸溶液沸水浴20min，使细胞破碎。

菌体油脂采用索氏抽提法，即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。

由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。

2.微生物油脂菌株培养
1）高产油脂菌株的筛选
用于生产微生物油脂的菌株要求具备以下条件：
(1)具备或改良后具备合成油脂的能力，油脂积累量大，含油量
稳定在50%以上且油脂转化率不低于15%。

(2)能利用农副产品及工业废水、废料。

(3)繁殖力旺盛，杂菌污染困难，沉淀、过滤、分离油脂容易。

(4)油脂风味良好，食用无害，易消化吸收。

(5)用于工业化生产时能适应工业化深层培养，装置简单。

此外菌种不同，培养条件不同，产品也不同。

一些菌株油脂的脂肪酸组成、类型及甘三酯组成
2）菌株的选择
脂肪粒计数法、苏丹三菌泥染色法、碳饥饿检出法
3）菌株的制备
①微生物油脂的生产工艺流程如下：
菌种筛选一—原料——灭菌——菌体培养——菌体收
集——预处理——油脂提取——精炼成品油脂。

②菌体的培养
大量的试验证明，不同种属的微生物，其油脂含量、油脂成分各不相同。

即使同一种微生物在不同的培养条件下，其产油量和油脂成分也不尽相同。

与此相关的培养条件主要有碳源、氮源、温度、pH 值等。

碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖等；氮源有胺盐、尿素等。

微生物培养可采用液体培养法、固体培养法和深层培养法。

4）培养基包含的各成分对对菌体产油脂的影响
a.碳源和氯源对菌体产油脂的影响
碳源是微生物产油脂的一个关键因素，当培养基中碳源充足而其它营
养成分缺乏时，微生物菌株会将过量的碳水化合物转化为脂类。

目前最常用的碳源是葡萄糖，因为以葡萄糖为碳源可获得更高的菌体生物量，而且其价格相对于其它碳
源更便宜，有利于降低成本。

氮源的主要作用是促进细胞的生长，高C／N有利于菌体生长，低 C／N 有利于油脂的积累，此外氮源的种类也会影响油脂的积累。

b.培养时间对菌体产油脂的影响
微生物细胞的油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异，如油脂酵母的油脂含量在生长对数期较少，在生长对数期末期开始急剧增加。

至稳定期初期达到最多。

培养时间的长短也是一个影响因素，培养时间不足，菌体总数少而影响油脂产量；培养时间过长，细胞变形、自溶，合成的油脂进入培养基中难以收集，同样影响油脂产量。

此外，不同微生物的最佳培养时间也不相同。

c.温度对菌体产油脂的影响
温度的改变之所以能调节脂肪酸成分。

是由于细胞对外界温度的化会产生一种适应性反应。

通常情况下，不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低，短链脂肪酸的熔点比长链脂肪酸低。

因此当菌株从高温转移到低温时，细胞膜不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕桐油酸或油酸等含量的增加；当温度升高时，平均链长就增长，有利于细胞膜的正常流动和增强其通透性。

d.pH值对菌体产油脂的影响
不同种类的微生物，产油的最适pH值也不同，霉菌的为中性至微碱
性。

油脂酵母培养基的初始 pH值越接近中性，稳期菌体的油脂含量越高。

在培养过程中不断调整 pH值，使微生物处于其最适 pH值范围内。

可有效地提高微生物的产油量。

e.通气量对菌体产油脂的影响
油脂是由基质的糖类还原而成，当微生物产生油脂时，必须供给大量氧气，不饱和脂肪酸的生物合成也需要大量氧气。

研究发现，产油真菌在供氧不足的条件下，甘油三酯的合成会强烈受阻，并引起磷脂和游离脂肪酸大量积累；在通气条件
下。

游离脂肪酸会部分转化成含有2个或3个双键的脂肪酸，从而使不饱和脂肪酸大量增加。

f.无机盐对菌体产油脂的影响
对真菌而言，适当增加无机盐和微量元素的添加量可提高油脂合成速度和产油量。

在培养基中适当增加 Na，K，Mg等元素含量。

日本长沼等人员研究证明，在培养基中适当增加Fe，Zn离子，可加速产油微生物对油脂的合成，但添加量不宜太大，否则会严重阻碍真菌对油脂的合成。

3. 发酵条件的优化方法
1）培养基的优化通常包括以下几个步骤：
①所有影响因子的确认；
②影响因子的筛选，以确定各个因子的影响程度；
③根据影响因子和优化的要求，选择优化策略；
④实验结果的数学或统计分析，以确定其最佳条件；
⑤最佳条件的验证。

5.）优化方法
经以上几种方法的比较，我们可以通过把几种试验方法的结合，减少实验工作量，但又得到比较理想的结果。

首先充分调研和以前实验的基础上，用部分因子设计对多种培养基组分对响应值影响进行评价，并找出主要影响因子；再用最陡爬坡路径逼近最大响应区域；最后用中心组合设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。

已经有许多报道利用这几种试验相结合的方法成功地优化了目的菌株的发酵培养基。

另外，在缺乏某一菌株的生理代谢和合成调控机制知识的情形时，可通过摇瓶实验先用Plackett-Burman法从手边可获得的多种培养基中确定出重要因素，然后用响应面优化设计法或均匀设计法得到各重要因素的最佳水平值。

五、课堂报告讲述过程中希望讨论的问题
1.高产油脂微生物油脂提起方法?
2.培养基外其他影响微生物培养的条件?
3. 微生物不同生长阶段特点比较?。