血清成分分析

血清成分分析

作者：管忠健指导老师：贾守菊学号：10112314113

（温州大学生命与环境学院，10生本）

摘要：血清中含有有各种血浆蛋白（α、β、γ-球蛋白、清蛋白）、多肽、胆固醇、谷丙转氨酶、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。实验通过邻苯二甲醛法测定血清胆固醇的含量；通过盐析、透析与浓缩等方法分离血清中的清蛋白和γ-球蛋白并用醋酸纤维素薄膜电泳进行鉴定；通过纸层析法鉴定谷丙转氨酶活性。同时我们又探究比较家鸡和乌鸡血清中的胆固醇含量、谷丙转氨酶活力。

关键词：血清、家鸡、乌鸡、胆固醇、清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶

前言：血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。血清清蛋白与γ-球蛋白是血清的重要成分，通过实验掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法；掌握凝胶过滤层析的技术方法；掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。谷丙转氨酶是肝功能检查项目中一项比较灵敏的指标，实验用纸层折法观察肝脏谷丙转氨酶（ALT）的转氨基作用；用分光光度法测定血清谷丙转氨酶的活力。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、

肝和胆汁中含量也高。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。血清胆固醇是测定血脂的常规项目，试验用邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇，来比较家鸡与乌鸡血清的区别。

一、实际材料、试剂和器材

（一）材料分析

乌鸡血清、家鸡血清、动物肝脏

（二）试剂

1、血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）

（1）邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛（A.R.）50mg，以无水乙醇（A.R.）溶解并稀释到50mL，冷藏，有效期1个半月。（2）90%醋酸（3）标准胆固醇应用液（0.1mg/mL）（4）混合酸：取试剂2加等体积浓硫酸混匀即成。（5）标准胆固醇贮液（1mg/mL）：准确称取胆固醇（A. R.）100mg以醋酸定容至100mL。

2、血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定

（1）血清（2）PBS（3）（NH4）2SO4溶液（4）双缩脲试剂（5）酪蛋白（6）蔗糖（7）BaCl2溶液3、凝胶层析

（1）Sephandex 4B 凝胶（2）生理盐水（3）5%重铬酸钾（4）5%蓝葡聚糖

4、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

（1）0.9% NaCl溶液 (2)海砂（3）1% 谷氨酸溶液（1%KOH

溶液中和）（4）1% 丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1% KHCO3溶液

（6）0.025% 溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2% 乙酸溶液（8）、苯酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡。静止24h后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。（9）0.1% 水合茚三酮的正丁醇溶液 (10)0.1% 标准谷氨酸溶液

(11)0.1% 标准丙氨酸溶液 (12)1% KOH溶液

（9）（13）1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液:取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO49.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g 溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。

（14）GPT基质液（谷丙转氨酶底物）:取分析纯α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g置于小烧杯内，加入1mol/LNaOH溶液约10mL，使其完全溶解，并用1mol/LNaOH溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4，加磷酸缓冲液定容至100mL。可加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0微摩尔，丙氨酸200微摩尔。在冰箱内可保存一周。（14）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼:在200mL锥形瓶内放入分析纯2，4-二硝基苯肼19.8mg，加100mL 1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色瓶中，置冰箱内保存。缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。

（16）0.4mol/LNaOH溶液

（三）器材

离心机、移液管、透析袋、试管、吸管、容量瓶、烧杯、电子分析天平、分光光度计、铁架台、凝胶柱（10×1.0cm）、玻璃棒胶头吸管、吹风机、培养皿、滤纸、剪刀、恒温水浴锅、量筒。

二、实验方法与方案设计

实验一血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）

1、标准曲线的绘制

取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。

表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制

加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。

2、样品的测定

取3支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。

表3 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定

*硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。

显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在4~32℃时，颜色能稳定2h。

加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。

实验二血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定

（一）血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤

（二）蛋白质透析与浓缩的实验步骤

1. 取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。

2. 用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，流水透析1h。

3. 将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。

【三】凝胶层析的实验步骤