猪瘟病毒引起免疫抑制的研究

猪瘟病毒引起免疫抑制的研究
摘要：综述了猪瘟病毒引起的机体免疫抑制因素主要包括损伤免疫器官、诱导淋巴细胞凋亡、引起囊膜糖蛋白E2变异、抑制Ｉ型干扰素产生、诱发白细胞减少和引起树突状细胞无应答。

从而干扰抗原的递呈和抑制免疫抗体的产生。

引起机体免疫抑制。

关键词：免疫抑制性；免疫应答；猪瘟病毒
猪瘟(Classieal swine fever，CSF)是由黄病毒科(Fiaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪的高度接触性传染病。

病毒粒子大小为34-50nm，其芯髓直径约29 nm，为二十面体球状病毒，有囊膜，其膜厚约6nm。

CSFV与同属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)及羊边界病病毒(Border disease virus，BDV)在结构上有很高的相似性，在血清学上有交叉反应。

目前猪病毒性免疫抑制病是规模化猪场最常见的疾病之一，严重影响猪群的健康。

已经给世界养猪业造成了巨大的经济损失。

引起猪免疫抑制的病原复杂多变，不同的猪场病因可能完全不同，从而给疾病的诊断与预防带来了很大的困难。

多年的研究表明，该病因可能包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等。

近几年发现在猪重要的传染性病原中，猪瘟病毒与其他致病原混合感染，呈不断蔓延的趋势，在免疫抑制疾病发生过程中引起的作用日益增强，现将猪瘟病毒引起免疫抑制的因素综述如下。

1猪瘟病毒引起免疫器官的病变
全身皮肤、黏膜、浆膜和实质器官具有大小不等的出血点。

皮肤的出血主要见于颈部、腹部、腹股沟部和四肢的内侧，出血部位组织常可继发坏死，而成为黑褐色干涸的小痂。

皮下组织及肌肉内也可见到出血。

病毒由入侵处进入血流，早期主要在扁桃体隐窝黏膜上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞、白细胞和血小板。

引起扁桃体水肿，黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落，上皮下及隐窝周围淋巴细胞数量减少、淋巴组织坏死。

出血明显。

淋巴结水肿和网状细胞增殖，滤泡和生发中心增大，靠近皮质窦和小梁周围窦的透明区里的血管周围有红细胞渗出，红细胞聚集或浸润到整个淋巴组织中，网状细胞增殖，淋巴组织萎缩。

脾脏组织内淋巴滤泡中央动脉管壁发生透明变性，血管腔狭窄或闭塞，实质发生水肿、坏死和出血。

肾小球肿大，毛细血管壁及其内皮细胞肿胀、变性、肾小球囊内积有红细胞，间质内毛细血管也发生不同程度的肿胀和内皮细胞变性，肾小管上皮细胞有颗粒变性或脂肪变性。

非化脓性脑炎。

而在延脑、中脑、脑桥和丘脑最为明显。

如为典型病变，镜检时只需低倍放大即能识别。

反应限于血管周围的淋巴样细胞形成的管套变化。

神经实质的病变则是血管病变引起的继发变化。

常见的有少量
的神经细胞发生变性或神经胶质细胞增生形成结节。

猪瘟病毒感染后造成机体免疫器官的破坏引起免疫抑制，特别容易与其他疾病并发。

因此，CSFV对猪免疫器官的损伤是免疫抑制的主要原因。

2猪瘟病毒引起淋巴细胞凋亡
Hoffmann和Suinmerfield以及Gomez等的研究表明，猪瘟发生早期可在骨髓检测到高效价的CSFV，并可导致骨髓造血细胞的坏死和凋亡以及骨髓淋巴细胞凋亡，这表明外周血T淋巴细胞减少与CSFV导致髓淋巴细胞凋亡和血细胞生成系统受到损害有关。

Bruschke等报道，CSFV囊膜糖蛋白E(Em)在猪瘟病毒感染诱导淋巴细胞减少和免疫抑制的致病机制中发挥着重要作用，Em能够抑制伴刀豆蛋白A(Con A)诱导的猪、牛、羊和人淋巴细胞的增殖，并对淋巴细胞有细胞毒作用，Em与不同种属淋巴细胞体外共孵育可强烈抑制淋巴细胞的蛋白合成，诱导细胞的凋亡。

用免疫组织化学和TUNEL反应双标记试验检测CSFV和细胞凋亡以及TNF2α与细胞凋亡的相关性，结果病毒感染诱导的凋亡细胞数多于病毒感染细胞，显示CSV能够直接或间接地诱导淋巴细胞凋亡。

在TNF2α和细胞凋亡的相关性方面，标记的细胞或者TNF2α阳性，或者凋亡阳性，或者二者均阳性。

CSFV对猪的淋巴组织有嗜性，并可导致猪免疫系统的损伤。

在感染初期，CSFV就侵入猪的扁桃体及其外周淋巴结的B滤泡和上皮细胞中，并在其内复制。

随后CSFV扩展进入淋巴结的其他部分、内皮及上皮细胞。

原位杂交显示，作为病毒复制及侵入淋巴结位点的滤泡在晚期结构已遭到破坏。

另外，CSFV 还感染并损害淋巴组织的发生中心，阻碍B淋巴细胞的成熟，从而使在循环系统及淋巴组织中的B淋巴细胞缺失、胸腺萎缩、白细胞减少及骨髓也遭到了破坏，这些数据表明，CSFV感染诱导淋巴结淋巴细胞凋亡可能有两种方式，一是病毒感染直接诱导淋巴细胞的凋亡，二是CSFV感染的巨嗜细胞释放一种或多种细胞因子(如TNF2α)诱导未感染CSFV细胞的凋亡。

也有分析认为。

CSFV感染细胞分泌到胞外大量的病毒糖蛋白Em，Em诱导了邻近未感染CSFV细胞的凋亡。

由此可见，CSFV感染诱导外周血淋巴细胞减少可能是多种机制作用的结果，
3猪瘟病毒引起E2蛋白变异
CSFV E2基因所编码的糖蛋白gp55已被证明是CSFV的主要结构蛋白，能诱导机体的保护性反应，是CSFV的主要免疫保护抗原，尤其是单独的E2蛋白可以保护猪抵抗CSFV的感染。

E2蛋白在CSFV各毒株间的保守性要远低于Em 蛋白，其抗原性呈复杂性与多样性发展。

因此，CSFV在自然进化过程和长期的疫苗选择压力下，可能会通过改变其抗原性来逃避宿主的免疫监控，达到持续性
感染的目的。

采用竞争性结合手段、中和反应及突变株分离等技术。

已证实了在E2分子上存在4个独特的抗原结构域A、B、C和D，A区又包括3个亚抗原结构域A1、A2和A3。

其中B、C区是诱导产生中和抗体的主要部位，为非保守区；A1和A2在猪瘟病毒中最为保守，A1能诱导产生中和抗体；A3和D区既不保守也不诱导产生中和抗体。

有资料报道，E2基因是CSFV全基因组中变异最大的部分，约为3.2％～25.0％。

对E2基因进行测序和遗传进化分析，对其编码序列的分析能充分说明病毒的变异和遗传进化有关。

Lowings等对CSFV基因组5’端非编码区(NTR)的150nt、E2基因、NS5B基因中409nt序列分别进行了系统发生树分析比较，发现E2基因区域能最好地区分不同时期、地区的CSFV株，因而E2基因在CSFV的研究中倍受重视。

Lowings等对20多个不同时期、不同地方的115株疫苗株、经典毒株、流行毒株的E2基因部分核苷酸序列的遗传进化关系进行了比较和分析，构建了CSFV的遗传发生树，揭示出CSFV可分为两大基因群(Group)，5个基因亚群(Subgroup)，其中Group 1可分为2个基因亚群，Group 2可分为3个基因亚群。

涂宜强等把16株CSFV流行野毒株的E基因核苷酸序列与石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株进行比较表明，近期流行的毒株不仅与石门株、疫苗株距离较远，而且流行毒株呈不同亚群方向演变。

廖素环等将广西的15个CSFV流行野毒株的E2基因核苷酸序列与疫苗株比较，在可诱导产生中和抗体的抗原B区和C区，流行野毒株与疫苗株氨基酸序列同源性为81.1％～84.2％，并且在多个与特定单抗反应的氨基酸位点发生变异。

van Rijn等证实，CSFV在这些特定单抗反应的氨基酸位点的改变，将导致毒株逃脱与特定单抗的免疫反应。

通过对我国CSFV 流行野毒株与传统的石门强毒株及我国广泛应用的猪瘟兔化弱毒疫苗株的E2序列的比较，可以看到，目前我国的CSFV流行野毒株在E2抗原基因上均存在较大的变异现象。

E2蛋白结构的改变尤其是在抗原表位上的改变，都可逃脱抗体对病毒的清除，这也是当前造成CSFV持续性感染的一个主要原因。

4猪瘟病毒抑制Ｉ型干扰素的产生
IFN-I是一类具有抗病毒活性、引起免疫细胞增殖和免疫调节作用的蛋白质，包括IFN-β、IFN-ω和多个IFN-α亚型。

IFN-I可与细胞膜上的特异性受体结合，引发级联性的信号放大过程，将信号最后传递到细胞核内，对一系列干扰素刺激基因(ISG)的表达进行调控，诱导靶细胞产生特异性抗病毒蛋白，如双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)、2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶等，并引发各种生理反应。

I 型IFN的产生依赖于包括干扰素调节因子3(in-terferon regulatory factor 3，IRF3)、NF2KB、ATF22等转录因子的激活，其中，IRF3是一个重要的诱导抗病毒基因转录的转录因子，可以诱导一系列干扰索刺激因子的转录。

Proruggli等发现缺失了Npro基因的CSFV突变株(△N proCSFV)尽管生长特性、蛋白表达水平与CSFV的相似，但不能阻止poly(I:C)诱导细胞产生IFN-I和出现细胞凋亡；相反，在无poly(I:C)存在的条件下，AN proCSFV能诱导细胞产生IFN-I。

将N蛋白单
独表达于PK-15细胞，细胞在辛德毕斯病毒感染后没有WN-α的分泌，而且IRF3蛋白的细胞浆也减少。

这些结果都证明了CSFV对细胞抗病毒体系的干扰与其Npro蛋白的存在有关。

IRF3还参与了病毒诱导的细胞凋亡途径。

它的减少对于CSFV在体外细胞培养中的持续感染也是很关键的。

CSFV持续性感染的细胞对poly(I:C)诱导的细胞凋亡有抗性，这是否与CS-FV抑制IRF3有关还有待研究。

CSFV持续性感染的细胞与人工缺失IRF3表达的细胞系一样都可以正常地生存和分化，与未受感染的细胞一样有着相同的生长特性，只是不能对病毒产生干扰素应答。

CSFV是采用何种机制来抑制IRF3基因的转录以及CSFV对宿主细胞RNA合成的影响，目前尚未清楚，但是在裂谷热病毒感染中，病毒的靶目标是转录因子TFIIH，从而导致宿主细胞RNA合成的抑制。

辛德毕斯病毒在感染细胞后2h就可检测到IFN的分泌，但是。

CSFV和辛德毕斯病毒共感染细胞后，CSFV可以抑制辛德毕斯病毒诱导细胞产生IFN，此时CSFV尚处于感染早期，病毒蛋白还未合成。

因此，CSFV可能还有其他机制来抑制IFN的产生。

目前，已发现丙型肝炎病毒和登革热病毒有多种机制来抑制IFN的产生，对于CSFV 是否还有其他抑制IFN产生的机制。

还有待进一步研究。

5猪瘟病毒诱发白细胞减少和引起树突状细胞无应答
白细胞减少和免疫抑制是猪瘟发生早期的临床特征。

用流式细胞仪对Annexin V-FITC和PI染色液标记的感染组和对照组猪白细胞进行凋亡检测的结果，攻毒猪(攻毒后第四天)，感染组凋亡细胞占细胞总数的平均值为7.23％，对照组凋亡细胞平均值为1.40％，凋亡细胞比例显著高于对照组。

感染组处于凋亡早期的细胞数量也明显高于对照组，达到33.86％，比对照组高25.68％。

白细胞的减少与外周血淋巴细胞减少、与CSFV导致骨髓细胞凋亡、与血细胞生成系统受到损害有关㈦。

Bruschke等报道，CSFV囊膜糖蛋白Em在猪瘟病毒感染诱导白细胞减少而造成免疫抑制。

CSFV机体免疫反应的启动仅有抗原和淋巴细胞是不够的，必须要有具有抗原递呈功能的辅佐细胞的存在，树突状细胞(Dendritic cell，DC)作为专职抗原递呈细胞，具有强大的抗原递呈能力和免疫调节能力。

DC位于病原入侵的门户——黏膜和皮肤表层，通过其受体捕获病原后迁移至引流淋巴结，发育成熟并递呈抗原，启动和诱导T淋巴细胞分化产生免疫反应或直接激活B淋巴细胞及产生记忆效应。

Carrasco等用CSFV Brescia株体外感染DC，发现CSFV不诱导DC产生IFN-α；感染后的DC无任何形态、表型或功能的改变。

仍然保持着抗原递呈能力和有能力诱导T淋巴细胞的抗病毒应答。

尽管只是体外的CSFV感染DC试验，没有完全反映出体内DC系统的复杂性，但是在一定程度上反映了CSFV可能采取一种未知的机制来控制或限制作为机体免疫应答过程中的启动者和控制者——DC的激活，允许CSFV在DC内复制并利用DC可以从黏膜表面迁移到二级淋巴组织的特点，造成对淋巴组织的损害。

6小结与展望
CSFV产生免疫抑制，引起机体不能产生能够起到保护作用的抗体，造成CSFV与其他病原菌混合感染猪群，从而使各种疾病复杂化，给诊断和免疫带来困难及对养殖业造成巨大的损失。

由于CSFV的广泛传播给养猪业带来的严重危害，世界各国对CSF给予了高度重视，并投入了大量的人力物力对其进行研究。

现在尽管已经取得了较大的进展，但仍有许多问题尚待阐明。

我国对CSFV复制过程、与宿主细胞间的关系、致病机制以及各种防治手段研究还不是很深入，需要加大力度预防和控制CSFV的发生。