《环境仪器分析》第七章 分子荧光光谱法 (2)

荧光光谱曲线
激发光谱：ex max最大激发波长 发射光谱：em max最大发射波长
荧光光谱特征： （1）stokes位移 （2）ex一般不影响em sp的形状 （3）吸收光谱和发射光谱成镜像关系。
激发光谱与发射光谱的关系
A：stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射波长比激发波
③能够引起荧光的化学物质较少，应用范围小。 大多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入
某种试剂后能够产生荧光。
Ⅳ、荧光法的应用
1.定量方法
①标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制
标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度。 ②比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 再进行比较。
2.无机物的荧光分析
无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通 过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或 猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧 光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。
光路：紫外可见分光光度计入射光与透射光在同 一直线上；荧光分光光度计激发光与发射光相互 垂直；
样品池：紫外可见风光光度计的吸收池两面透光 ，荧光分光光度计的样品池四面透光。
分子荧光光谱法的特点
①灵敏度高
荧光分析是由试样溶液所发生的荧光的强度来测定试样 溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓 度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度 有关．因此荧光分析的灵敏度高于一般的分光光度法．最低 检出限比分光光度法低一个数量级以上，适合于痕量物质的 检测。
S1
能 量
T1
发
发
射
外转换
射
荧 光
磷 振动弛豫 光
S0
l
l l
l
①非辐射跃迁及能量传递过程
振动弛豫（10-12 s） 由于分子间的碰撞，同一电子能级以热能量交
换形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。 激发态分子常常首先发生振动驰豫。
内转换：（10-8s） 同多重度电子能级中，等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动驰豫，高激发单重态的电子跃回
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I）
I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
溶液浓度较低时：
F K I0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
电子激发态的各个振动能级； （2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过 无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级； （3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降 落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这
就是荧光： （4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光 谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在 通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。
光致发光
物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激 发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射 三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁， 都经过激发态。而能量传递则是由于激发态的运动。紫外 辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。
2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
荧光和磷光的产生 1.单重态和三重态
基态单重态（singlet state）：自旋电子成对，只有一种自旋方向，↑↓，电子 自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示； 谱线的多重性只与价电子的总自旋量子数S有关，其值为2S+1. 当基态电子激发到某高能级时，将有两种激发态： 即受激电子自旋相反与自旋平行：↓↑h、↑↑h。自旋平行时多重性为M = 2 ×1+1=3，称为激发三重态（triplet state），用T表示。自旋相反时多重性为1 ，称为激受单重态，用S表示。
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
（1）S态电子自旋相反，T态电子自旋平行； （2）ts = 10-8 s, tT = 10-4 ~ 1 s; 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基
态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
分子内的光物理过程
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
荧光的影响因素
（1）分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的刚性与共平面结构。只有少数具有某些结构 特性的体系才会产生荧光现象。 （2）分子内及分子环境中没有诱导非辐射跃迁基团。
满足以上条件的分子具有一定的荧光量子 产率：
荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ） 表示：
具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧 光素有很强的荧光，酚酞却没有。
（4）取代基效应：苯环上有吸电子基常常会 妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。
化合物
C6H6（苯） C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN
相对荧光强度 10 3 0 17 18 20 20 20
含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧 光减弱，磷光增强。
④溶解氧
往往使荧光强度降低。
Ⅲ、荧光分析仪
测量荧光的仪器主要由四个部分组成： 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
I0 F
I
（1）光源：
钨灯，汞灯，氙灯wenku.baidu.com激光
激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范 围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密 度，强度：影响测定的灵敏度。
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外
光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ，
与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。
检测器： 光电倍增管。
问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计有 什么区别？
荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐 射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。
（2）环境因素
①温度 温度对荧光的影响很大。 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，
因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液 在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温 度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。
第一激发单重态的最低振动能级。
系间窜越（10-8 s） 不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃
迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨道耦 合进行。
外转换：（10-8 s） 激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能
量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。 荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的
的速率常数较小，有利于荧光的产生。
共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光
最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构 的脂肪族化合物也可能产生荧光。
（3）平面刚性结构效应 可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故
②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与
pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态， 从而使其荧光发生变化。
化合物 C6H5OH C6H5O— C6H5NH2 C6H5NH3 +
相对荧光强度 18 0 20 0
③溶剂
溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移。
若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电 离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。
第七章 分子荧光光谱法 Molecular Fluorescence Spectroscopy
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
灭。
②辐射跃迁
荧光： 受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰
豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，多为 （S1 →S0），以辐射的形式失活回到基态，发出荧 光。
由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因 此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比 激发光波长长。
荧光产生的过程：
（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照 射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一
后回到基态的最低振动能级．
磷光：
若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第 一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低 振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光 线称为磷光。
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷 光的波长比荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。 因此磷光很少应用于分析。
（2）超强基团 氧负离子（-O-）
强给电子基团 二烷基氨基（-NR2）、烷基氨基（-NHR）、氨基（-NH2） 、羟基（-OH）、烷氧基（-OR）
中等基团 酰胺基（-NHCOR）、酰氧基（-OCOR）
弱给电子基团 烷基（-R）、羧基甲基（-CH2COOH）、苯基（-Ph）
（5）荧光与金属螯合物
荧光波长/nm 270~310 310~390
270~320 285~365 285~345 310~405 280~360
C6H5Cl C6H5Br C6H5I
7
275~345
5
290~380
0
（1）吸电子基团是当取代基取代苯环上的氢后，苯环上 电子云密度降低的基团；反之，苯环上电子云密度升高的 叫供电子基团。
光源、单色器、光路、样品池、检测器
（1）光源：紫外-可见分光光度计的光源为氘灯 与钨灯；荧光分光光度计的光源为氙灯，强度更 大。
（2）单色器：紫外-可见分光光度计只有一个单 色器，荧光分光光度计包含激发、发射两个单色 器。
问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计有 什么区别？
发射荧光的分子数 发射的光子数 Φ = 激发态的分子数 =吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关：

kf
k f ki kec kic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
（2）荧光与结构的关系
单重态： 一个分子中所有电子自旋都配对的电 子状态。
三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状 态。
大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且 自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所 以大多数分子在基态时处于单重态。
当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某 两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃 迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。 但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生 成三重态。
比UV ~ Vis高2-4个数量级，检测下限：0.1 ~ 1 µg/cm-3. 在合适 的条件下，可以达到单分子水平。
②选择性好。 凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率
的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于 某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光 波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和 荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．
长长，振动驰豫消耗了能量。 B. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如
能级图λ1，λ2），产生不同的吸收带，但均回到第一季 发单重态的最低振动能级在跃迁回到基态，产生波长一定 的荧光。 C 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。