化妆品微生物检测

不同品牌的化妆品中微生物污染状况检测

[目的要求]

1、学会化妆品中菌落总数及霉菌、酵母总数的检测方法及检测原理；

2、检测市场上一些化妆品的微生物是否超标；

[实验原理]

任何一种化妆品或药物，在生产、保存、运输和使用过程中，由于各种不同的原因，其产品质量可能发生质变。这些原因其一就是由所谓微生物所造成的，微生物是一群形体极微小的生物，它一般包括细菌、酵母菌、霉菌和病毒等。化妆品或药物受到微生物的污染，可引起产品物理性状（如色泽、气味等）变化，改变产品有效成份，有的还会引起致敏、毒素和病毒感染，因此必须严格控制化妆品或药物中的微生物。

菌落总数是指检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分，培养温度，培养时间，pH值，需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。

霉菌和酵母菌总数是指检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌菌落总数，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。

[实验器材]

l．培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（菌落总数）；虎红培养基（检测霉菌及酵母总数）；卵磷脂，吐温80—营养琼脂培养基

2.仪器或其他用具 90ml装无菌生理盐水；9ml装无菌生理盐水；9cm灭菌平板，锥形瓶，玻璃涂棒，移液枪；Tip头；培养箱；水浴锅；无菌棉签；超净工作台；高压蒸汽灭菌锅等。

[实验步骤]

一、化妆品的微生物学污染状况检测

1、样品采集

按无菌方法随机抽取各种品牌牙膏、成人护扶品（膏、霜、洗面奶、爽肤水、粉饼等）、婴幼儿用护扶品（爽身粉、面霜等）。

2、样品预处理

在化妆品中通常都加入了防腐剂，使化妆品能较长时间使用而不腐败变质，因此在进行化妆品卫生细菌学检验时，必须消除化妆品中的防腐剂，使长期处于濒死状态或半损伤状态的细菌被检出，从而得出正确的检验结果。

消除防腐剂抑菌作用的方法，常用的方法有：

（1）稀释法：用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无抑菌作用的程度，再进行检验。

（2）中和法：在供试液或培养基中加入中和剂，以中和防腐剂的抑菌效果。防腐剂种类不同所用的中和剂亦不同。本实验采用吐温80+卵磷脂来做中和剂。

3、样品的制备

（1）液体样品

○1水溶性的液体样品，量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10检液

○2油性液体样品，取样品10mL，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃～44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL(在40℃～44℃水浴中预温)，在40℃～44℃水浴中乳化，制成1：10的悬液。

（2）膏，霜，乳剂半固体状样品

○1亲水性的样品，称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。.取其上清液作为1：10的检液。

○2疏水性样品，称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液体石蜡,研磨成粘稠状，再加入10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液。（3）固体样品，称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液。

如有均质器，上述水溶性膏，霜，粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏，霜及眉笔，口红等，称10g样品，加10mL灭菌液体石蜡，10mL灭菌吐温80，70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min。

4、菌落总数检验

（1）用灭菌吸管吸取1：10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液，各吸取1mL，分别注入到两个灭菌平皿内。如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000，1：10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。

（2）将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。

5、霉菌和酵母菌数的检测

取1：10的检液各1mL分别注入2个灭菌平皿内, (若菌量较多时可顺序再做10倍稀释)，另取1个灭菌空平皿(作空白对照)，每皿分别注入融化并冷至45℃左右的虎红培养基约15mL，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置28℃培养箱，培养3天，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h应及时将此平板取出计数。

6、菌落计数方法

（1）菌落总数技术

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该

平皿不宜计数.若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。

（2）霉菌和酵母菌菌落计数

先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在20～100个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g(或每mL)检样中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。

每g(或每mL)化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)表示。

7、评定标准

化妆品的微生物学质量应符合下述规定：

（1）眼部、口唇、口腔粘膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品细菌总数不得大于500/ml或500/g。（2）其它化妆品细菌总数不得大于1000/ ml或1000/g。

[注意事项]

（1）所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10ml。包装量小的样品，取样量可酌减。

（2）供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得启开，以防再污染。

（3）制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。

（4）注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。

（5）在检验过程中，从开封到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行。或在相应条件下，按无菌操作规定进行。

二、口服药物的微生物学污染状况检测

1、样品采集

按无菌方法随机抽取各种品牌牙膏、成人护扶品（膏、霜、洗面奶、爽肤水、粉饼等）、婴幼儿用护扶品（爽身粉、面霜等）。

2、样品的制备

按无菌方法取药粒10g或10ml投入到装有90ml的无菌生理盐水中，摇动至完全溶解，即为1：10样品液，按前述方法相应可制备1：100、1：1000的稀释液。

2、菌落总数检验

将融化并冷至45℃～50℃的营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15m营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。

4、霉菌和酵母菌数的检测

取1：10的检液各1mL分别注入2个灭菌平皿内, (若菌量较多时可顺序再做10倍稀释)，另取1个灭菌