金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响(一)

金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响(一)

作者：李丽立，刘云华，侯德兴，印遇龙，张彬，侯振平，邱细敏

【关键词】金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪

【Abstract】AIM:ToinverstigatetheeffectsofexogenousZnmetallothionein(ZnMT)onantioxidativefunctionandge neexpressionofSODinweaningpiglets.METHODS:Eighteenpiglets(Duroc×Landrace×Yorkshire)were selectedanddividedinto3groups(1,2and3)randomly.Thepigletsweresporttoproducestress.ZnMTofp igletliverdissolvedinphysiologicalsalineweretheninjectedintothepigletsofgroup1,2and3withthecon centrationsof0,0.8,1.6mg/kg,respectively.Threeand6hlater,3pigletswereselectedfromeachgroupra ndomlyandslaughteredtogetliversamples.Thebiochemicalindexesrelatedtoantioxidationandthelev elofSODgeneexpressioninliverweredetermined.RESULTS:AfterZnMTinjection,theactivitiesofSODan dGSHPXincreasedsignificantly(P0.05)，thecontentofMDAdecreasedsignificantly(P0.05),andthelevelofantireactiveoxygenspeciesandantis uperoxideanionhadthetrendofimprovement.SixhoursafterZnMTinjection,thelevelofSODgeneexpr essioningroup2and3increasedsignificantlyascomparedwiththatingroup1(P0.05).ThelevelofSODgen eexpressioningroup2and3at6henhancedsignificantlyascomparedwiththatat3h.Thus,ourdataindica tedthatZnMTtreatmentstimulatedSODmRNAexpressioninatimeanddosedependentmanner.CONCL USION:ActivityofantioxidasecanbeincreasedbysupplementofZnMT,therebyimprovingthepowerofa ntistress.

【Keywords】metallothionein;antioxidativeenzyme;geneexpression;piglet

【摘要】目的：用仔猪作模型，研究经锌元素诱导的外源性金属硫蛋白（ZnMT）对机体抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达的影响.方法：选用杜长大杂交仔猪18头，随机分为3组(1,2和3）.分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT0mg/kg(1组），0.8mg/kg（2组）,1.6mg/kg（3组），让仔猪运动产生应激.注射MT后3h和6h，分别从每组取3头仔猪屠宰取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平.结果：在应激条件下，补充外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性显著升高(P0.05)，MDA含量显著降低(P0.05)，肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势.在注射ZnMT 后6h，0.8mg/kg，1.6mg/kg组仔猪肝脏SOD基因表达水平比对照组显著提高(P0.05).0.8mg/kg 组和1.6mg/kg组6hSOD基因表达水平比3h显著增加，表明MT对SOD基因表达的诱导与时间和剂量关系密切.结论：补充外源性ZnMT可提高应激机体的抗氧化物酶活性，从而提高机体的抗应激能力.

【关键词】金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪

0引言

应激可使机体脂质过氧化反应增强，继而通过产生自由基造成组织损伤,致生物体病变，生产力下降，甚至死亡〔1〕.金属硫蛋白（metallothionein,MT）是分子量低、富含半胱氨酸的金属结合蛋白.研究表明，MT具有显著的清除自由基、抗脂质过氧化和增强机体免疫力的作用〔2-3〕.因此，MT通过清除自由基，可增强抗氧化酶的活性，阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤，减少DNA损伤.因而将MT应用于动物，完全有可能达到缓解氧化应激，提高生长速度，减少疾病的发生，减缓鲜肉氧化速度，延长动物利用年限，提高经济效益的目的.但以往有关金属硫蛋白的抗氧化、抗应激研究以内源性为主，而且大都仅从抗氧化酶的活性变化来探讨金属硫蛋白清除自由基、抗氧化的作用.有关MT在猪体内的研究鲜见报道.基于此，我们以杜长大杂交仔猪为对象，通过注射外源性ZnMT，测定肝脏与自由基有关的生化指标以及肝脏中SOD基因表达水平，从蛋白和基因水平探讨外源性ZnMT在应激状态下对抗氧化酶的影响.

1材料和方法

1.1材料选用胎次、日龄相同并且体质量相近的杜长大三元杂交雄性仔猪18头，14d一次性断奶，单栏饲养，自由采食和饮水.试验前体质量（4.42±0.24）kg.屠宰前1d停食，不断水.梯度PCR仪：德国Eppendorf生产，型号为5331055888；稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂生产，型号为DYY6B；凝胶成像系统：美国UVPBiolmagingSystem生产，型号为GDS8000；紫外分析仪：北京六一仪器厂生产，型号为WD9403B；紫外分光光度计：德国Eppendorf 生产，型号为603105430；超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司生产，型号为BD396LT65W；台式离心机：德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge5415D；低温离心机：德国Eppendorf 生产，型号为Centrifuge5810R；微波炉：青岛海尔股份有限公司生产，型号为HR6702DW.猪肝ZnMT：本课题组提取的产品；BIOXYTECHSOD525TM试剂盒：购自OXIS公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒、超氧阴离子(SOA)自由基测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；ISOGEN总RNA抽提试剂盒：购自日本基因株式会社；RTPCR试剂：购自AmershamPharmaciaBiotech公司；琼脂糖及Tris：购自Roche公司；GeneRulerTM100bpDNALadder：购自MBIFermntas公司.

1.2方法

1.2.1试验设计将18头供试仔猪，随机分为3组，每组6头.驱赶仔猪使其产生应激，然后3组分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT0mg/kg（1组），0.8mg/kg（2组）,1.6mg/kg（3组）.在注射MT后3h和6h，分别从每组随机抽取3头仔猪，从前腔静脉放血屠宰，取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平.

1.2.2样品采集解剖时取两份1g左右的肝脏迅速用无菌锡铂纸包好并编号于液氮中速冻，再转移至-70℃冰箱中以备总RNA的抽提和肝脏上清液的制备.