第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)

质
基
粒
因
提
扩
取
增
序列分析Βιβλιοθήκη Baidu
5、 人工合成基因
◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核 苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以 很快地人工合成基因。
磷酸二酯法
亚磷酸三酯法
寡核苷酸连接法
5、 人工合成基因
◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡 核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重 叠序列，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合 酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新 链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物， 经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一 起，经SOE-PCR(sequence overlapped extension， SOE)扩增出完整的基因片段。
（1）套式PCR （2）反向PCR （3）不对称PCR （4）锚定PCR （5）长程PCR （6）反转录PCR （7）锅柄PCR
Bt886Cry3Aa基因的克隆
F-2k：5' ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3' R-2k：5' TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3'
高密度遗传学图谱
4、 PCR克隆
基于PCR的DNA克隆与基于载体的克隆 技术相比具有一定优越性。
➢PCR反应速度很快，可以在几个小时内 完成，而载体克隆需要几周时间。
➢PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量 样品的DNA。 ➢对于部分降解、甚至污染，用载体克隆 无法进行的DNA样品，PCR扩增仍可获得 目的基因克隆
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）
◆理想的核基因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 ◆检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
◆例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17 kb，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
cDNA文库的构建步骤
分为六个阶段： 阶段1： mRNA反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：纯化cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
◆ 以mRNA为模板，经反 转录酶合成互补DNA
(◆cD绝N大A)多c，D数构N真A建核文的生库基物因筛库选。的优点 mRNA的cD3N′端A具文有库一仅段包多含正在表达的基因 聚A(po不ly-同A)尾物端种序、列不。同在组织的cDNA文库不相同 反T引转物录(p酶基ri作因m用e总r)下，量，引少用导，p合o易l成y-筛选
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
名词：无性繁殖系 动词：形成DNA分子、细胞或个体的无
性繁殖系的过程 形容词：克隆的 载体
植物转化
组织培养 幼苗克隆
第二节 目的基因的克隆方法
1、转录水平的克隆 2、基因组水平上的克隆 3、蛋白质组水平的克隆
1、转录水平的克隆
EST
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
克隆的核酸酶
2、基因组水平上的克隆
将所有的遗传物质克隆到细菌中----DNA文库
基因组文库(gene library) ：将某种生物的基因组DNA切割 成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞， 进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集 合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。
（1）相关概念及cDNA文库
基因的差别表达:生物个体发育的 不同阶段、或在不同的组织器官中、 或在不同的环境条件下发生的不同 基因按一定时间和空间有序表达的 方式称为基因的差别表达。
cDNA文库
(Complementary DNA library)
以组织细胞中的mRNA为模板，反 转录合成双链cDNA ，各cDNA分子 分别插入载体形成重组子，再导入 宿主细胞克隆扩增。这些在重组体 内的cDNA的集合即cDNA文库。
限制化学法合成基因的因素
➢ 已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源 的基因更少；
➢ 化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装 才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备 难度加大；
➢ 化学基因合成相比之下比较昂贵。
植物转化
培养基
卡那霉素
不含有表 达目的基因
cDNA文库 铺平板
转膜 转膜
提取分离 ｍＲＮＡ
cDNA 探针
提取分离 ｍＲＮＡ
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的Ｘ光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的Ｘ光片中有 的印斑，可对照Ｘ光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
➢扣除杂交
来源相似 而功能有 异的两种
T-DNA 载体构建
↓ 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
↓ 筛选T2，获突变子，应为3:1分离
↓ 确定T-DNA与突变型共分离的个体
↓ 产生纯合后代
↓ 克隆T-DNA两侧的植物DNA
↓ 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因
↓ 基因功能的验证
（3）图位克隆
又叫 (或候选基因克隆) ,是根据目的基因的位置特性而非其 编码产物来克隆。成功分离目的基因须具备三个必要条件： 分子标记 高密度遗传图谱 染色体步移法分离目的基因
一条互补DNA，即第一条 DNA链，形成RNA-DNA 杂合双链。然后合成第2 条链。
（2）如何从cDNA文库中找到所需要的基因？
转录水平上的基因克隆方法
差别杂交筛选 扣除杂交 代表性差别分析 差异显示 cDNA阵列杂交 基因表达系列分析 抑制差减杂交
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
样品
检测方 mRNA
反转录为 cDNA
过量(10倍) 的驱动方 mRNA进 行杂交
富集目的基因
构建扣除cDNA文库 筛选目的基因
经过柱或其他方 法去掉双链杂合体
差别显示技术
根据生物大分子间的相互作用分离 目的cDNA克隆
酵母双杂合系统 真核生物的位点特异转录激活因子：BD AD
基于EST信息的基因克隆
第六章 目的基因的分离克隆
基 因 工 程 的 步 骤
目的基因
把需要研究的基因称为目的基因 为使优良性状聚集于同一生物体， 在生物群体中分离编码蛋白的结构基因， 并在此基础上创造出有价值的新物种。 生物界的长期进化积累了大量对人 类有用的基因，这是一个宝贵的资源。
第一节 克隆的概念
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
◆通常的方法是，尽量提取 大分子量的核DNA，用限制 性酶酶切后，分离选择具有 一定长度(大于15kb)的DNA 片段，与适宜的载体连接构 成重组DNA分子, 选择相应 的宿主细胞用于克隆。载体 可以是质粒，噬菌体，BAC 或YAC等
文库构建流程
抽提基因组 DNA
鸟枪法制备DNA片段
DNA片段与载体重组
文 库 的 抗 体 筛 选
（2）T-DNA标签克隆基因
基本原理：
➢利用T-DNA插入突变创造突变体，获得 各突变体的纯合材料；
➢然后分析突变性状与T-DNA的共分离关 系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆 技术获得T-DNA的侧翼基因组序列；
➢用其作探针筛选基因文库，获取目标基 因或克隆，再进行下一步的分析 。
（1）基于基因文库的基因克隆
◆从基因库中筛选、分离基因，可根据对待 选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法 和条件。 ◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA， cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性 同位素或非放射性同位素标记探针，也可用 抗体作探针，筛选基因库。
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆