酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究
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酶浓度对酵母菌原生质体形成与再生的影响：将酵母 菌Y01培养9h后，分 别 采 用 2.0%蜗 牛 酶 +0 . 5 % 纤 维 素 酶 、 1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶和1.0%蜗牛酶+1.0%纤维素酶 于30℃酶解70min。将酵母菌Y05培养8h后，分别采用1.5% 蜗 牛 酶 +0.5% 纤 维 素 酶 、1.5% 蜗 牛 酶 、1.0% 蜗 牛 酶 +0.5% 纤维素酶和1.5%纤维素酶在30℃酶解50min，计算菌株的 原生质体形成率和再生率。酶液用4%NaCl高渗缓冲液配 制，原生质体稀释和再生采用15%蔗糖高渗缓冲液。
94.0
83.5
67.1
92.2
再生率/%
6.9
21.3
稳渗剂对酵母菌原生质体形成与再生的影响：酵 母 菌 Y01（菌 龄 9h）和 Y05（菌 龄 8h）采 用 脱 壁 酶（1.5%蜗牛 酶+0.5%纤维素酶）在 30℃ 进 行 酶 解 ，酵 母 菌 Y01 酶 解 70min，酵母菌Y05酶解50min。计算原生质体形成率与再 生率。分别用NaCl高渗缓冲液、甘露醇高渗缓冲液、蔗糖 高渗缓冲液作为渗透压稳定剂配制酶解液、稀释原生体 和配制再生培养基。
BAO Weixia, WANG Jingjie, WANG Xiaofei, CHEN Youqiang, XU Xuping*
(Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture; College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, 350108, China)
2010 No．9
·42· Serial No．222
China Brewing
Research Report
酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究
包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*
（农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室 福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350108）
摘 要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌（Sacc haromyces cerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌
原生质体的形成率及再生率的计算采用平板计数法[4-5]。 1.2.3 原生质体制备与再生条件实验
菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响：按照1.2.1 方法将酵母菌Y01分别培养至7h、9h、11h和13h后，将细胞 浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，取5mL，4000r/min 离 心5min弃上清液，菌体用PB缓冲液洗涤2次，加入脱壁 酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解70min。酵母菌 Y05分别培养至6h、8h、10h和12h后，同上步骤加入脱壁酶 （1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解50min。酶液配制 采用4%NaCl高渗缓冲液，原生质体稀释和再生采用15% 蔗糖高渗缓冲液。计算原生质体形成率与再生率，以确定 用于制备原生质体的最佳菌龄。
（Kluyveromyces marxianus）原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h，采用
1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制
酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。
原生质体融合技术具有杂交频率高、重组种类多、遗 传信息传递量大等优点，目前已广泛应用于微生物菌种的 改良中。酿酒酵母Y01是一株具有良好发酵性能[1]，能够利 用甘蔗汁发酵生产酒精的优良菌株，但其最适生长温度 为30℃，最适发酵温度为32℃，不能适应高温酒精发酵；而 马克斯克鲁维酵母Y05具有较强的耐热性，在40℃时仍能 正常生长，但是产酒率较低。为了得到一株既耐高温又高 产酒精的新型酵母菌株，拟采用原生质体融合技术对酿 酒酵母和马克斯克鲁维酵母进行杂交。原生质体的制备 与再生是融合前提，据文献报道，酵母菌原生质体的再生 较为困难，再生率较低[2-3]。为了克服这一问题，本研究对 两亲本的原生质体制备和再生条件进行了优化，为后续 的原生质体融合育种创造条件。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌种
总第 222 期 ·43·
体，菌体用PB缓冲液洗涤2次，无菌加入酶液，置30℃水浴 中，100r/min振荡处理，每隔20min取样制片镜检，待视野 中有90%以上的细胞脱壁成为原生质体时，2500r/min离心 10min收集原生质体，用蔗糖高渗缓冲液洗涤3~5次，经高 渗缓冲液适当稀释后，涂布于高渗再生培养基平板，酵母 菌Y01置30℃（Y05置37℃）恒温培养2d~3d。
组合3 组合4
项
配制 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 NaCl高渗 酶液 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
稀释原 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 蔗糖高渗
目
生质体 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
配制再生 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 蔗糖高渗 培养基 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
Y01原生质 体形成率/%
菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形成和再生的影 响，结果见图1。
由图1可以看出，菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形 成 率 与 再 生 率 影 响 显 著 ，以 对 数 生 长 中 期 为 宜 ，酵 母 菌 Y01菌龄为9h，酵母菌Y05菌龄为8h时，原生质体的形成率
和再生率最佳。当酵母菌处于对数生长早期时，菌体较稚 嫩，容易被酶破坏而死亡。菌龄到达对数生长晚期至稳定 期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体， 原生质体形成率显著下降，Y05再生率也下降[6]。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.2 渗透压稳定剂种类对酵母菌原生质体形成与再生的 影响 由于原生质体对渗透压非常敏感，在低渗溶液中可
立即破裂。因此，在原生质体制备过程的各个环节，均需 在高渗环境中进行，以保护原生质体免于膨胀破裂，而且 还有助于酶与底物的结合。由于菌种不同，其最佳稳定剂 也不同。设计了几种不同组合的稳渗剂，比较其对原生质 体形成率和再生率的影响，结果（附表）。可以看出，采 用 NaCl 高 渗 缓 冲 液 配 制 酶 液 、稀 释原生质体及配制再生培 养基，有利于Y01和Y05原生质体的形成，但不利于其再 生。就再生率而言，以甘露醇高渗缓冲液和蔗糖高渗缓冲 液的效果较好，但其形成率较低，可能是因为糖溶液的黏 度大，造成酶与细胞接触不良，降低了酶对细胞的作用。 糖是酵母的良好碳源，有利于细胞壁的再生及细胞的正 常生命活动。综合考虑原生质体的形成率和再生率，可以 确定采用NaCl高渗缓冲液配制酶液，采用蔗糖高渗缓冲液 稀释原生质体和配制再生培养基为最佳组合（组合4）。
附表 渗透压稳定剂对Y01和Y05原生质体形成与再生的影响 Attached table. Effect of stabilizer for osmotic pressure on formation
and regeneration of protoplast of Y01 and Y05
组合1
组合2
Abstract：Effects of hypha age, enzyme concentration, stabilizer for osmotic pressure and enzymeolysis time on the protoplast formation and regeneration of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus were studied. The optimum conditions for protoplast formation and regeneration were as follows: S. cerevisiae aged at 9 h, hydrolysis with 1.5% snailase and 0.5% cellulase under 30℃ for 70 min; K. marxianus aged at 8 h, hydrolysis with 1.0% snailase and 0.5% cellulase under 30℃ for 50 min; 4% NaC1 for stabilization of osmotic pressure in preparation of enzymolysis solution，and 15% cane sugar solution for dilution and medium of regeneration culture. Key words：Saccharomyces cerevisiae; Kluyveromyces marxianus; protoplast formation and regeneration
1%，pH值为5.4；②氯化钠高渗培养基：在YPD培养基中 添加4%氯化钠，调pH值为6.0；③蔗糖高渗培养基：在YPD 培养基中添加15%蔗糖，调pH值为6.0；④甘露醇高渗培养 基：在YPD培养基中添加15%甘露醇，调pH值为6.0。固体 培养基成分同上，另加2%琼脂，115℃灭菌30min。 1.1.3 主要试剂
酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）由本实验室保藏， 文中简称酵母菌Y01；马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）1911购自中国工业微生物菌种保藏中心，文中 简称酵母菌Y05。 1.1.2 培养基
①YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸出汁
酶解时间对酵母菌原生质体形成与再生的影响：在 最佳菌龄、最佳酶浓度、最佳稳渗剂条件下，酵母菌Y01分 别酶解50min、70min、90min和110min，酵母菌Y05分别 酶 解 30min 、50min 、70min 和 90min ，计算菌株的原生 质体形 成率和再生率。 2 结果与分析 2.1 菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响
（1）PB溶液：pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 （2）高渗缓冲液（PBS）：①蔗糖高渗缓冲液：PB溶液 加入15%蔗糖；②甘露醇高渗缓冲液：PB溶液加入15%甘 露醇；③NaCl高渗缓冲液：PB溶液加入4%NaCl。以上试剂 均115℃灭菌30min。 （3）脱壁酶：蜗牛酶和纤维素酶，使用时按所需浓度用 高渗缓冲液配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌（现配现用）。 1.2 方法 1.2.1 菌体培养 将酵母菌Y01和Y05分别转接一环入YPD液体培养基 中 ，酵 母 菌 Y01 置 30 ℃（Y05 置 37 ℃）、200r/min 振 荡 培 养 24h。取上述培养物按0.3%的接种量接入新鲜的YPD液体 培养基中，同上条件培养至一定时间，将细胞浓度调整为 3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，用于制备原生质体。 1.2.2 原生质体的制备与再生 取上述培养的菌液5mL，4000r/min离心5min收集菌
收稿日期：2010-02-27 基金项目：国家“948”项目基金（2006-G37）；农业公益性行业科研专项（nyhyzx07-019）；福建省教育厅资助项目（JB09029） 作者简介：包伟霞（1986-），女，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究工作；许旭萍*，教授，通讯作者。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 9 期
关 键 词：酿酒酵母；马克斯克鲁维酵母；原生质体的形成与再生
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）09-0042-03
Protoplast formation and regeneration of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus
94.0
83.5
67.1
92.2
再生率/%
6.9
21.3
稳渗剂对酵母菌原生质体形成与再生的影响：酵 母 菌 Y01（菌 龄 9h）和 Y05（菌 龄 8h）采 用 脱 壁 酶（1.5%蜗牛 酶+0.5%纤维素酶）在 30℃ 进 行 酶 解 ，酵 母 菌 Y01 酶 解 70min，酵母菌Y05酶解50min。计算原生质体形成率与再 生率。分别用NaCl高渗缓冲液、甘露醇高渗缓冲液、蔗糖 高渗缓冲液作为渗透压稳定剂配制酶解液、稀释原生体 和配制再生培养基。
BAO Weixia, WANG Jingjie, WANG Xiaofei, CHEN Youqiang, XU Xuping*
(Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture; College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, 350108, China)
2010 No．9
·42· Serial No．222
China Brewing
Research Report
酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究
包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*
（农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室 福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350108）
摘 要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌（Sacc haromyces cerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌
原生质体的形成率及再生率的计算采用平板计数法[4-5]。 1.2.3 原生质体制备与再生条件实验
菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响：按照1.2.1 方法将酵母菌Y01分别培养至7h、9h、11h和13h后，将细胞 浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，取5mL，4000r/min 离 心5min弃上清液，菌体用PB缓冲液洗涤2次，加入脱壁 酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解70min。酵母菌 Y05分别培养至6h、8h、10h和12h后，同上步骤加入脱壁酶 （1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解50min。酶液配制 采用4%NaCl高渗缓冲液，原生质体稀释和再生采用15% 蔗糖高渗缓冲液。计算原生质体形成率与再生率，以确定 用于制备原生质体的最佳菌龄。
（Kluyveromyces marxianus）原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h，采用
1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制
酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。
原生质体融合技术具有杂交频率高、重组种类多、遗 传信息传递量大等优点，目前已广泛应用于微生物菌种的 改良中。酿酒酵母Y01是一株具有良好发酵性能[1]，能够利 用甘蔗汁发酵生产酒精的优良菌株，但其最适生长温度 为30℃，最适发酵温度为32℃，不能适应高温酒精发酵；而 马克斯克鲁维酵母Y05具有较强的耐热性，在40℃时仍能 正常生长，但是产酒率较低。为了得到一株既耐高温又高 产酒精的新型酵母菌株，拟采用原生质体融合技术对酿 酒酵母和马克斯克鲁维酵母进行杂交。原生质体的制备 与再生是融合前提，据文献报道，酵母菌原生质体的再生 较为困难，再生率较低[2-3]。为了克服这一问题，本研究对 两亲本的原生质体制备和再生条件进行了优化，为后续 的原生质体融合育种创造条件。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌种
总第 222 期 ·43·
体，菌体用PB缓冲液洗涤2次，无菌加入酶液，置30℃水浴 中，100r/min振荡处理，每隔20min取样制片镜检，待视野 中有90%以上的细胞脱壁成为原生质体时，2500r/min离心 10min收集原生质体，用蔗糖高渗缓冲液洗涤3~5次，经高 渗缓冲液适当稀释后，涂布于高渗再生培养基平板，酵母 菌Y01置30℃（Y05置37℃）恒温培养2d~3d。
组合3 组合4
项
配制 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 NaCl高渗 酶液 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
稀释原 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 蔗糖高渗
目
生质体 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
配制再生 NaCl高渗 甘露醇高渗 蔗糖高渗 蔗糖高渗 培养基 缓冲液 缓冲液 缓冲液 缓冲液
Y01原生质 体形成率/%
菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形成和再生的影 响，结果见图1。
由图1可以看出，菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形 成 率 与 再 生 率 影 响 显 著 ，以 对 数 生 长 中 期 为 宜 ，酵 母 菌 Y01菌龄为9h，酵母菌Y05菌龄为8h时，原生质体的形成率
和再生率最佳。当酵母菌处于对数生长早期时，菌体较稚 嫩，容易被酶破坏而死亡。菌龄到达对数生长晚期至稳定 期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体， 原生质体形成率显著下降，Y05再生率也下降[6]。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.2 渗透压稳定剂种类对酵母菌原生质体形成与再生的 影响 由于原生质体对渗透压非常敏感，在低渗溶液中可
立即破裂。因此，在原生质体制备过程的各个环节，均需 在高渗环境中进行，以保护原生质体免于膨胀破裂，而且 还有助于酶与底物的结合。由于菌种不同，其最佳稳定剂 也不同。设计了几种不同组合的稳渗剂，比较其对原生质 体形成率和再生率的影响，结果（附表）。可以看出，采 用 NaCl 高 渗 缓 冲 液 配 制 酶 液 、稀 释原生质体及配制再生培 养基，有利于Y01和Y05原生质体的形成，但不利于其再 生。就再生率而言，以甘露醇高渗缓冲液和蔗糖高渗缓冲 液的效果较好，但其形成率较低，可能是因为糖溶液的黏 度大，造成酶与细胞接触不良，降低了酶对细胞的作用。 糖是酵母的良好碳源，有利于细胞壁的再生及细胞的正 常生命活动。综合考虑原生质体的形成率和再生率，可以 确定采用NaCl高渗缓冲液配制酶液，采用蔗糖高渗缓冲液 稀释原生质体和配制再生培养基为最佳组合（组合4）。
附表 渗透压稳定剂对Y01和Y05原生质体形成与再生的影响 Attached table. Effect of stabilizer for osmotic pressure on formation
and regeneration of protoplast of Y01 and Y05
组合1
组合2
Abstract：Effects of hypha age, enzyme concentration, stabilizer for osmotic pressure and enzymeolysis time on the protoplast formation and regeneration of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus were studied. The optimum conditions for protoplast formation and regeneration were as follows: S. cerevisiae aged at 9 h, hydrolysis with 1.5% snailase and 0.5% cellulase under 30℃ for 70 min; K. marxianus aged at 8 h, hydrolysis with 1.0% snailase and 0.5% cellulase under 30℃ for 50 min; 4% NaC1 for stabilization of osmotic pressure in preparation of enzymolysis solution，and 15% cane sugar solution for dilution and medium of regeneration culture. Key words：Saccharomyces cerevisiae; Kluyveromyces marxianus; protoplast formation and regeneration
1%，pH值为5.4；②氯化钠高渗培养基：在YPD培养基中 添加4%氯化钠，调pH值为6.0；③蔗糖高渗培养基：在YPD 培养基中添加15%蔗糖，调pH值为6.0；④甘露醇高渗培养 基：在YPD培养基中添加15%甘露醇，调pH值为6.0。固体 培养基成分同上，另加2%琼脂，115℃灭菌30min。 1.1.3 主要试剂
酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）由本实验室保藏， 文中简称酵母菌Y01；马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）1911购自中国工业微生物菌种保藏中心，文中 简称酵母菌Y05。 1.1.2 培养基
①YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸出汁
酶解时间对酵母菌原生质体形成与再生的影响：在 最佳菌龄、最佳酶浓度、最佳稳渗剂条件下，酵母菌Y01分 别酶解50min、70min、90min和110min，酵母菌Y05分别 酶 解 30min 、50min 、70min 和 90min ，计算菌株的原生 质体形 成率和再生率。 2 结果与分析 2.1 菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响
（1）PB溶液：pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 （2）高渗缓冲液（PBS）：①蔗糖高渗缓冲液：PB溶液 加入15%蔗糖；②甘露醇高渗缓冲液：PB溶液加入15%甘 露醇；③NaCl高渗缓冲液：PB溶液加入4%NaCl。以上试剂 均115℃灭菌30min。 （3）脱壁酶：蜗牛酶和纤维素酶，使用时按所需浓度用 高渗缓冲液配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌（现配现用）。 1.2 方法 1.2.1 菌体培养 将酵母菌Y01和Y05分别转接一环入YPD液体培养基 中 ，酵 母 菌 Y01 置 30 ℃（Y05 置 37 ℃）、200r/min 振 荡 培 养 24h。取上述培养物按0.3%的接种量接入新鲜的YPD液体 培养基中，同上条件培养至一定时间，将细胞浓度调整为 3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，用于制备原生质体。 1.2.2 原生质体的制备与再生 取上述培养的菌液5mL，4000r/min离心5min收集菌
收稿日期：2010-02-27 基金项目：国家“948”项目基金（2006-G37）；农业公益性行业科研专项（nyhyzx07-019）；福建省教育厅资助项目（JB09029） 作者简介：包伟霞（1986-），女，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究工作；许旭萍*，教授，通讯作者。
研究报告
中国酿造
2010 年 第 9 期
关 键 词：酿酒酵母；马克斯克鲁维酵母；原生质体的形成与再生
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）09-0042-03
Protoplast formation and regeneration of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus