苯酚生物降解菌的筛选

灭菌、 倒平板： 121℃， 灭菌 20min， 倒平板， 各菌株、 各浓度 配置两 个
菌悬液制 备：将初 选的培养 液作适度 稀释，或 将保藏的 经单碳源 实验的菌 株用无菌 水制成菌 悬液
涂平板：用 1mL移液管分 别从各菌悬液 试管中取菌悬 液0.2mL涂布 于药物培养基 平板上，每一 试管菌悬液涂 布一组不同浓 度的苯酚药物 培养基平板， 每一浓度设平 板两个，六组 共计12个
培养： 恒温 培养 箱 30℃ 培养 1-2 天
筛选：观 察、记录 并挑选高 浓度药物 培养基平 板上生长 旺盛的菌 落，此即 高耐受性 苯酚降解 菌，接种 于牛肉膏 蛋白胨培 养基斜面
保藏： 编号， 4℃冰箱 保藏
实验结果
1．苯酚耐受菌株的初选结果
平板编号 药物浓度 （g/L） 1 2 3 4 5 6 7 8
B
C
D
苯酚耐受菌株的初选
平板涂布：用1mL移液管分别从 浓度梯度培养基平板制备： 样品菌悬液制备：将采集的 各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL 按培养基C的方法制成苯酚 土样溶解于无菌水中，摇匀， 于苯酚梯度平板上，用涂棒涂 作适度稀释，备用 浓度梯度平板 布均匀
1
2
3
培养：恒温 培养箱30℃ 培养1-2天
4
5
注意事项
各种培养基的配制 应严格按配方的要
A B
涂布梯度平板 的菌悬液只作 适度稀释，菌
C
涂布平板的菌
悬液不要过多
或过少，0.2mL 为宜
求完成，尤其是苯 酚的称量和pH
浓度不必过低 梯度平板上挑
单碳源实验的
E
D
取菌落时，要 挑取单菌落
培养基和培养 条件一定要严 格把握
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苯酚生物降解菌的筛选
Screening of phenol biodegrading bacteria
实验目的 实验基本原理
实验用品 方法步骤 实验结果及分析
注意事项Biblioteka Baidu
实验目的
1·掌握微生物分离纯 化的基本操作 2·掌握用选择性培养 基从土壤中分离苯酚 生物降解菌的原理和 方法
基本原理
苯酚是芳香烃化合物。苯酚是常用的消毒剂，能 意志柠檬酸循环。但在部分细菌中存在芳香烃的降解 质粒，将其降解为三羧酸循环的原料或中间产物。
器材
仪器
试管、250ml三角烧瓶、1 mL吸管、吸耳球、无菌 涂棒、量筒、天平、灭菌锅、培养箱、酒精灯、 接种环、棉花、棉线、牛皮纸
试剂
牛肉膏 蛋白胨 苯酚 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 FeSO4 琼脂
培养基的配置
A
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl 5g，琼脂15-20g , 水1000 mL，PH 7.0-7.5 药物培养基：将一定量苯酚加入到牛肉膏蛋白胨 培养基中制成 苯酚浓度梯度平板：在无菌培养皿中，先倒入710 mL 含0.1g/L苯酚的牛肉膏蛋白胨培养基，将培 养皿一侧置于木条上，使培养皿中培养基倾斜成斜 面，且刚好完全盖住培养皿底部；待培养基凝固后， 将培养皿放平，再倒入7~10 mL牛肉膏蛋白胨培养基 以苯酚为单碳源的液体培养基：NH4Cl 1.0g ， K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4 0.06g,，FeSO4 3mg，苯酚按设计量添加，水1000 mL ，PH 7.0-7.5
在苯酚浓度梯度培养基平板高含药区上分离出的 菌落，对苯酚具有较好的耐受性，可能具有分解酚菌 的能力；然后将其在以苯酚为唯一碳源的培养基里进 行摇床培养，淘汰掉不能利用苯酚的菌株，可筛选到 苯酚降解菌；再用不同浓度的苯酚药物培养基分离，
可筛选出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。
实验用品
材料 实验土样采自校园肥沃土
平行样两
瓶
白培养基
作对照， 检测各摇
释，接种
于对应摇 瓶中
养 2天
1.2g/L六个
浓度梯度配 制
瓶菌体浓
度
高耐受性苯酚降解菌的筛选
药物培养 基平板的 配制：按 不同浓度 （0.2 g/L ， 0.4 g/L ， 0.6 g/L ， 0.8 g/L ， 1.0 g/L ， 1.2 g/L） 苯酚配置 药物培养 基平板
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
高药区单 菌落数
实验结果
2. 以苯酚为单碳源的菌株的筛选结果（生长情况OD值）
药物浓度（g/ L ） 1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
2
菌 种 编 号 3 4 5
实验结果
3. 高耐受性苯酚降解菌的筛选结果（菌落数）
药品浓度 （g/L）
1 2 菌 株 号 3 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
7 检测：用
8
筛选：淘汰 掉不能利用
灭菌：
每菌株、
每药物浓 度各配置
培养基D的
配方，用 250mL三角 瓶，每瓶装 50mL，制成 以苯酚为单 碳源的液体 摇瓶
121℃，
20min
分光光度
计测定OD 值，以空
苯酚为碳源
的菌株。菌 体浓度高的 为生长较好 者，即能以 苯酚为单碳 源的菌株， 可进行下一 步实验
以苯酚为单碳源的菌株的筛选
1
单碳源培养 基配制：按
2
苯酚的浓度 设定：苯酚 的浓度分别 按0.2g/L， 0.4g/L， 0.6g/L， 0.8g/L， 1.0g/L，
3
平行样：
4
5 接种：将 初选的苯 酚耐受性 菌株，分 别用少许 无菌水稀
6 培养：八 层纱布盖 口，回旋 式摇床， 30℃，100 转/min培
4
5
6
挑取菌落：由于在培养基平板中，药物浓度呈由 培养、保藏：将接种 低到高的梯度方式分布，平板上长成的菌落也呈 现由密到稀的梯度分布，而高浓度药物区生长的 后的斜面于恒温培养 少数菌落一般具有较强的抗药性。挑取高含药区 箱中30℃培养1-2天， 编号，4℃冰箱保藏 的单个菌落于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上划线