现代分离与分析技术

《现代分离与分析技术》考题

一、色谱分离过程中，样品组分在柱内的分子运动具有那些基本特征？液固色谱、化学键合相色谱和排阻色谱的分离原理是什么？其适用于分离分析哪些样品？（20分）

1 基本特征：1）差速迁移：不同组分在柱子中移动的速度不同而是其混合物得到分离。2）普带扩展：同一组分颜色铺筑移动时色带有窄变宽。

2分离原理：

1）液-固色谱：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子）于是，在固定相表面发生竞争吸附，试样中各组分据此得以分离。（适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高的选则行）。

2）化学键合相色谱：化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合

相应用最广泛。化学键合相色谱所用活动相的极性必须与固定相明显不同，根据活动相和固定相的相对极性不同分为：正相键合相色谱法：活动相极性小于固定相极性。常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保存值可用加进适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。反相键合相色谱法：反相键合相色谱法应用最广泛，由于它以水为底溶剂，在水中可以加进各种添加剂，改变活动相的离子强度、pH 值和极性等，以进步选择性。

3）排阻色谱法：排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，从而使各组分得到分离。（适用与分离酶，蛋白质，多糖，核酸）。二、A和B两种化合物在某溶剂中的分配比分别为9和2，通过多次萃取可以将其分开吗？为什么？请计算说明。（20分）

要达到完全分离，即分离度R=1.5

由α=KA/KB=9/2=4.5

k=ＫA/β=9/(100-9)=0.1

16(Rs)2=n[(α-1)/α]2

经计算得：n=59.4

即经过60次萃取，可以将A和B两种化合物分离开来。

三、为什么离子交换、吸附分离的动态过程比静态过程分离更完全？（20分）

离子交换：静态交换是一种间歇式交换，将溶液和离子交换剂共同放入同一容器，利用震荡，搅拌达到平衡后，用倾析过滤或离心等方法使固液两相分离，然后分别处理。动态交换是指溶液与树脂层发生相对移动，包括固定床柱式交换和活动床的连续交换。活动床连续交换的特点是交换，再生，清洗等操作在交换装置的不同部位同时进行。因此，动态过程接触面积更大，分离更完全。

吸附分离：在吸附分离过程中包含了动态过程和静态过程，静态吸附描述了吸附剂对目标产物吸附量的情况，动态吸附则更能体现吸附传质速率和实际操作。在动态吸附的过程中吸附的平衡起始浓度是一样的，平衡终止浓度也相同，在吸附的过程中，吸附的动力学、吸附推动力比静态吸附推动力大，促使动态吸附比静态吸附完全，再者，在吸附的过程中，由于吸附柱的大小对吸附有一定的影响，静态吸附可能在一定程度上不能对整个系统中吸附到，而动态吸附是一个流动的过程，各个地方是等价的，因此，动态吸附比静态吸附更完全。

四、简述分离方法选择的原则；以植物多糖的分离分析为例，讨论和分析分离方法的选择及其应用效果。（20分）

1：分离方法的成熟（技术和应用）程度。2：有限选用分离因子较大的分离方法。3：尽量避免使用极端工艺条件（温度压力，PH值等）。

4：当分离过程需要多个分离级时，优先选择平衡分离过程而不选择速率分离过程。5：当分离因子相同时，优先选择采用能量分离剂的分离过程而不选择采用质量分离剂的过程。6：不少情况下，采用耦合/集成分离方法。随着分析测试技术的不断提高，糖生物学的发展和新技术的不断涌现，越来越多的化学、物理、生物的分析方法被应用来植物多糖的分离分析。

光分析法：测定糖的传统分析方法中，根据其还原性，将糖转变成糠醛衍生物进行测定，或用酶法来测定。多糖的测定常采用苯酚- 硫酸法和蒽酮- 硫酸法，利用分光光度法测定，可对多糖进行定量或定性分析。但是不能用于总多糖的定量测定

酶法：是对葡萄糖专一性的分析方法，它的专一性高，灵敏度高。但受到特异性及样品中污染物干扰的限制。

色谱分析方法：可分离、不破坏样品、精确和快速等特点。随着现代分析技术的发展及仪器的联用，已成为多糖结构分析中不可缺少的手段

1）薄层色谱技术:：对仪器设备要求不高，操作简便快捷，随着自动点样仪、薄层扫描仪的应用，现代薄层逐步实现自动化。单糖、双糖、寡糖、多糖及其衍生物都可通过薄层色谱得到满意的分离和鉴定。通过调节不同的流动相，使之在薄层板上进行分离，再用不同的显色剂加以鉴定。

2）气相色谱是多糖分析中最重要的手段之一。它具有选择性好，样品用量少，分辨率高，灵敏度高等优点。对于糖的研究，由于糖类物

质通常含有－NH－、－OH、－SH 等极性基团，这些基团内的氢键作用增强了分子内部的吸引力，使得糖类本身没有足够的挥发性，必须在气相色谱分析前预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。气相色谱和质谱联用技术在复杂糖类物质定性定量分析方面具有独特优势。

3）凝胶色谱法又称分子筛色谱法，由于设备简单、操作方便, 不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

4）离子交换色谱法是利用树脂对不同种类的糖在吸附作用上的差异，使混合物中各糖达到彼此分离的目的。糖在水溶液中虽不以离子形式存在，但可通过形成离子配合物的方式间接实现糖的分离，因此具有某种结合型的强酸性或弱酸性阳离子树脂，强碱性或弱碱性或大孔球形阴离子树脂广泛应用于糖的分离。

5) 高效液相色谱法HPLC 已经成为分析糖类物质最主要的方法。糖的传统检测方法，采用柱后反应和可见光检测器检测，将糖衍生化后进行色谱分离，后来采用灵敏度较低的示差折射检测器直接测定，但RID 的灵敏度较低且不能用于梯度洗脱。

6) 高效毛细管电泳(HPCE)法是20世纪80年代发展起来的一种新型的分离分析技术，它以快速、高效和灵敏度高、所需样品少和抗污染能力强等优点被广泛用于各个领域，主要集中在单糖和寡糖的分离检测方面。由于糖类物质一般缺少紫外或荧光生色基团，用高效毛细管电泳法测定糖类物质，一般都需要进行柱前衍生化。