植物基因转化及转基因植物地分析报告与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

〖实验目的〗

1．了解创建烟草突变体库的方法；

2．理解每种方法的基本原理；

3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。

〖实验原理〗

随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。

烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。

T-DNA 载体构建

转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

筛选T2，获突变子，应为3:1分离

确定T-DNA与突变型共分离的个体

产生纯合后代

克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)

利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）

图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程

TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR 方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。

实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图

本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草，以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。〖仪器、材料和试剂〗

（一）仪器

高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。

（二）材料

烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。

（三）试剂

1. 2×CTAB提取液

100mmol/L Tris-HCl pH8.0

2％（w/v）CTAB

1.4mol/L NaCl

40mmol/L b-巯基乙醇

20mmol/L EDTA

2. TE缓冲液

10mmol/L Tris-HCl pH8.0

1mmol/L EDTA

3. 50´TAE电极缓冲液1000ml

Tris 54g

硼酸27.5g

0.5mol/L EDTA 20ml

4. 10％次氯酸钠

5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)

6. 70％乙醇

7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml

8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml

9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合

10. LB液体培养基

配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：

胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g

酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。

11. MS基本培养基

大量元素mg/L 微量元素mg/L 有机营养mg/L

NH4NO31650 KI 0.83 甘氨酸 2.0

KNO31900 H3BO3 6.2 烟酸0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6）0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1）0.l

KH2PO4170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇100

CoCl2·6H2O 0.025

CuSO4·5H2O 0.025

FeSO4·7H2O 27.8

配制方法

母液：

大量元素（50×）400mL

硝酸铵33g；硝酸钾38g；磷酸二氢钾3.4g；七水合硫酸镁7.4g；

铁元素（100×）200mL

七水合硫酸亚铁0.556g；七水合EDTA二钠0.746g；

有机营养（100×）200mL

Gly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇2g；烟酸0.010g；