毒品苯环利啶PCP单克隆抗体的制备及鉴定

云南大学学报(自然科学版),2003,25(增刊):217～219CN53-1045/N　ISSN0258-7971 Journal of Yunnan U niversity

Ξ毒品苯环利啶(PCP)单克隆抗体的制备及鉴定

马　涛,吕　琦,马　岚

(云南大学单克隆抗体工程技术中心,云南昆明　650091)

摘要:将毒品苯环利啶(PCP)与牛血清白蛋白(BSA)偶联形成复合抗原免疫Balb/c小鼠,获得6株稳定分泌抗PCP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.它们的腹水效价在1∶105～1∶106.抗体类型鉴定结果表明,属

于IgG1,κ型.这些抗PCP单抗均可用于毒品的免疫检测.

关键词:毒品;苯环利啶;单克隆抗体;酶联免疫吸附测定

中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2003)S-0217-03

苯环利啶(Phencyclidine,PCP)是毒品中的一种,被归为具有致幻作用的神经活性药物.在欧美、亚洲年轻的吸毒者中甚为流行,被称为“天使粉”.该致幻剂能影响中枢神经系统,引起感觉和情绪上的变化,导致自我歪曲和思维分裂,使人脱离现实,有时还可能引起精神病行为[1,2],严重影响人们的身体健康和生命安全.毒品问题一直是危及全球人类的、亟待解决的严重社会问题[3].人们在呼吁严打重治贬卖毒品者的同时,迫切需要解决现场快速检测毒品的问题.

利用毒品和毒品代谢物的抗体来检测吸毒者尿液中的抗原物质(毒品和毒品代谢物)是毒品检测中较为常用的免疫检测方法,其中免疫层析检测试纸是目前新兴的、可方便快速准确地检测毒品的方法.而应用单克隆技术获取抗体是研制免疫层析检测试纸的关键.

由于PCP分子较小,不易引起小鼠产生相应的体液免疫学反应,本研究以PCP与牛血清白蛋白(BSA)共价连接的结合蛋白PCP-BSA为免疫原,通过免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇细胞融合法获得了6株稳定分泌抗PCP单抗的杂交瘤细胞株,并对其进行了鉴定.

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　细胞和实验动物　NS-1骨髓瘤细胞,自本实验室.Balb/c小鼠,自北京实验动物中心.

1.1.2　主要试剂　DM EM培养基和小牛血清FBCS(Hyclone);HA T和HT(G ibco);聚乙二醇PEG(Fluka);G oat-anti-mIg G-HRP(Pierce); PCP-BSA(Arista);抗体亚类检测试剂盒(晶美生物技术有限公司).

1.1.3　主要设备　酶标仪(TECAN);CO2培养箱;紫外分光光度计(Beckman,Du640).

1.2　方法

1.2.1　小鼠免疫　取4～6周龄的Balb/c小鼠,以PCP-BSA进行免疫,皮下多点基础免疫2次,免疫剂量为50μg/只,8d后鼠尾取血进行免疫效果的检测,2周后,脾内注射法进行加强免疫,免疫剂量为100μg/只.

1.2.2　细胞融合、筛选与克隆　取免疫效果好的小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞以5∶1的比例按常规方法[2]进行融合.HA T选择培养基进行筛选,待克隆生长增殖至1/3或1/2孔时,进行抗体检测,即EL ISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在,确定杂交瘤细胞的阳性克隆情况.确定了阳性克隆后,按常规方法进行扩增和冻存.然后选取阳性值较高的细胞克隆进行有限稀释法单克隆化培养.

1.2.3　单抗效价测定　采用间接EL ISA法测定.即以BSA-PCP复合抗原包被酶标板,并设空白对照,37℃包被过夜,0.05%Tween-20的磷酸盐

Ξ收稿日期:2003-03-02

　作者简介:马　涛(1972-　),女,云南人,回族,硕士生,主要从事生物技术方面的研究.

缓冲液(PBS-T)洗5次.用1%BSA-PBS-T37℃封闭2h,PBS-T洗5次.加入待测样,以封闭液梯度稀释(10-1～10-8),并设空白、阴性、阳性对照孔,37℃孵育1h,PBS-T洗5次.加入抗鼠Ig G酶标二抗,37℃孵育1h.PBS-T洗5次, d2H2O洗3次.OPD-H2O2底物显色系统显色5～10min,测定OD值.

1.2.4　单抗类别鉴定　采用间接EL ISA法测定.二抗分别为抗鼠Ig G酶标抗体和抗鼠IgM和IgA 酶标抗体.其余操作同上述1.2.3.

1.2.5　杂交瘤细胞株的染色体分析　按常规方法[4]进行.

1.2.6　小鼠腹水的制备　选取10周龄的BALB/C鼠,腹腔注射石蜡油,剂量为0.5mL/只.7～10d后腹腔注射已克隆化的阳性杂交瘤细胞,数量为1.15×106～1.3×106/只;接种细胞7～10d 后抽取腹水,每隔2d放取1次,直至小鼠死亡;所收集的腹水1000r/min离心10min,收集上清,检测抗体效价,并于-20℃保存备用.

2　结　果

2.1　小鼠血清抗体效价检测　检测结果见表1.从表1的结果可知,2只免疫鼠的血清抗体效价都达到了10-6,说明免疫效果较好.

2.2　杂交瘤细胞株的建立　用PCP-BSA免疫鼠进行细胞融合,融合率为11%,用间接EL ISA 筛选,取OD值高的阳性孔细胞进行2次有限稀释,阳性率达100%,获得了6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(1B2a1,1D5a2,2H8a2,3G3a 2,6F12a1,6F12a2).

2.3　细胞克隆化培养过程中细胞上清的EL ISA 检测　检测结果见表2.

表1　免疫小鼠血清抗体效价

Tab.1Anti-PCP antibody titers of sera from immunized mice

免疫鼠

血清抗体效价

10-110-210-310-410-510-610-710-8 1++++++--2++++++--

表2　E L ISA检测培养细胞上清中PCP抗体滴度

Tab.2Anti-PCP antibody titers of supernatants from cultured cell lines by EL ISA

母细胞株OD值一次克隆化

细胞株

OD值

二次克隆化

细胞株

OD值

1B2 1.5721B2-5E8 1.6431B2a1 2.167 1D5 1.6131D5-6B11 1.6221D5a2 1.712 2H8 1.3752H8-14C8 1.7272H8a2 1.747 3G3 1.5393G3-42A12 1.8053G3a2 1.985

6F12 1.6536F12-23C6 1.8986F12a1 1.932 6F12a2 1.966

由上表可知,最终所获得的6株杂交瘤细胞株的OD值都在1.7以上,说明其分泌抗体的能力较强,在克隆化培养过程中,其OD值都呈稳定升高趋势,说明细胞株分泌抗体的稳定性良好.

2.4　核型分析结果　其结果见图1.其结果表明,杂交瘤细胞的染色体众数在90～97条之间,在NS-1(54～64条)骨髓瘤细胞染色体数和脾细胞(40条)染色体数之和的范围内,说明杂交瘤细胞株具有稳定分泌抗体的能力.

2.5　单抗类型的鉴定　按标准方法进行间接

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