多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义

多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义
[摘要] 多发性骨髓瘤是一种常见的浆细胞恶性肿瘤，重要的染色体与基因异常导致疾病的进展，在多发性骨髓瘤中具有独立的预后判断价值。

随着检测方法的更新及技术的进步，异常染色体与基因的检出率越来越高，主要包括13号染色体全部或部分缺失伴或不伴14q32/igh的重排等染色体异常。

异常染色体与基因的检测具有重要价值，可完善mm预后评估体系，指导临床个体化治疗并为新药开发提供新的靶点。

[关键词] 多发性骨髓瘤；分子细胞遗传学；预后
1染色体数目异常
1.1超二倍体
mm患者超二倍体主要表现为1、3、7、9、11、13、15、17、18、19、21、22三体型[1]；另外，近年来国内也有人发现mm患者8号染色体三体，王晓炜等[2]应用荧光免疫表型和间期细胞遗传学（fiction）技术对mm骨髓涂片进行8号染色体检测，9例mm患者中，发现8号染色体三体1例，这可能与应用fiction技术提高了检测效率有一定关系。

1.2亚二倍体
mm患者亚二倍体主要表现为6、8、13、14、x、y单体型为特征；其中13号染色体单体缺失及其部分缺失是目前研究较为广泛的染色体异常之一。

2染色体结构异常
2.113号染色体异常
13 号染色体部分或完全缺失是mm 最早发现的染色体异常，mm 中较常见，而且是mm预后及生存期预测的指标之一。

13号染色体异常，特别是13单体（-13）和13号染色体长臂部分缺失（13q-）与mm预后的关系越来越受到重视。

目前认为13号染色体上存在 mm 抑癌基因，其缺失与疾病危重、疗效和预后密切相关。

pérez-simón等[3]采用荧光原位杂交（fish）方法分析了15 种不同染色体异常在常规剂量化疗患者中的预后价值，发现13号染色体缺失是最重要的预示生存期短的预后指标，但对治疗反应无影响。

由于13q-的断裂点范围在13q11~13q14，rb1基因正好也于这个区域，因此有人推测13号染色体完全或部分缺失所致mm预后不良可能与rb1基因改变有关。

chiecchio等[4]通过fish技术对400例新发mm患者染色体检测发现，至少有一种染色体数目或结构异常者达99%，其中13号染色体缺失：单体缺失及部分缺失约占47%。

fonseca等[5]采用cig-fish 技术在54%的mm患者中检测到del（13q14），所使用的探针为rb1和d13s319。

shaughnessy等[6]采用11种探针涵盖13号染色体长臂以研究13号染色体缺失，发现86%的mm患者存在13号染色体缺失，最多的丢失位点是d13s272 （13q14.1，占76 %）和d13s31（13q14q21，占68%）两个13q14处不相连的片段。

而常见位点rb1
和d13s319 的缺失频率分别是52%和70%。

目前认为丢失13号染色体整个长臂或13号染色体完全缺失最常见。

2.214号染色体异常
14号染色体异常是mm最常见的结构异常，绝大多数是由于伙伴染色体与14号染色体交互易位造成；从而形成mm特殊的标记染色体14q+和14号染色体缺失即del（14）。

在mm中，应用fish技术检测14号染色体易位，可发现约20%~60%浆细胞伴有14号染色体易位；其中，t（11；14）（q13；q32）是最常见的改变[7]，占14号染色体易位的30%，其肿瘤细胞形态多为小裂浆细胞。

其他还有t（8；14）（q24；q31），t（14；18）（q32；q21），t（4；14）（p16；q32），及t（6；14）（q21；q32）等，染色体断裂点几乎都发生在14q32.3。

madoka takimoto[8]等应用fish技术检测23例mm患者，发现10例伴有14号染色体易位，约占43.5%，其中11q13/ccnd1占5例、16q23/maf4例、4p16/fgfr3仅1例。

2.2.1t（11；14）（q13；q32）takimoto等[8]应用fish技术检测23例mm患者，发现5例11q13/ccnd1易位，约占21.7%。

t（11；14）易位造成了cyclind1的过度表达，断裂点位于11号着丝粒端距cyclind1基因330kb处，无主要易位集簇区（mtc），其断裂点覆盖了整个cyclind1基因。

cyclind1蛋白与周期素依赖性激酶cdk4和cdk6联合作用可以使rb磷酸化而使细胞由g1期进入到s 期，是b细胞增殖的重要因子，与mm 发生关系密切。

t（11；14）
导致cyclin d1基因高度表达，则可能使细胞的增殖和分化出现异常。

由于人类骨髓瘤细胞系（hmcl）t（11；14）（q13；q32）的发生率明显增加，此易位可能造成mm 克隆增殖，从而使得疾病进展恶化。

临床发现有t（11；14）的mm细胞出现淋巴细胞样浆细胞的表型，且常规治疗效果较差。

研究发现有此易位的mm患者经大剂量化疗和干细胞支持后预后较好[9-11]。

2.2.2t（4；14）（p16.3；q32.3）这种染色体易位用常规细胞遗传学（cc）方法无法发现，然而用间期fish技术可以在15%～20% mm 患者中检出，目前尚未在其它b细胞肿瘤及其它非血液系肿瘤中发现t（4；14）异常，因此t（4；14）可能是mm特有的细胞遗传学改变。

4p16.3的断裂点位于染色体着丝粒端，距成纤维细胞生长因子3（fgfr3）基因50~100kb 处，易位到igh 的调节元件区如转录增强子和位点控制区（lcr），引起fgfr3表达失控；同时该易位可引起4号染色体mm set（multiple myeloma set domain）基因的表达明显增强。

由此可见，t（4；14）可同时影响fgfr3和mm set 两个基因的表达，易位形成igh-mmset融合基因。

fgfr3的高表达引起瘤细胞的增殖，凋亡受抑，而在正常浆细胞未能检出fgfr3表达。

mm set基因可编码具有32羟基232甲基戊二酸（32-hydroxy 232-methylglutariacid，hmg）功能域的核蛋白，该蛋白具有4个phd-锌指和1个set功能域；这几个功能域均编码与染色质重构有关的核蛋白，与细胞生长、分化的信号调控有关。

且经过对mm set
基因的dna和蛋白质序列分析发现mm set基因和hrx基因具有较高的同源性。

由此可以推测：t（4；14）（p16.3；q32.3）易位一方面引发fgfr3的高表达，使肿瘤细胞高速增殖，促进了肿瘤的进展；另一方面，mm set基因的表达，影响着骨髓瘤细胞的生长、分化，在肿瘤的转化及转归过程中起重要作用[12]。

2.31号染色体异常
2.3.11p-多数女性患者从冒烟型骨髓瘤发展为mm大约需4.5年时间。

在这个进程中，1p-及myc基因重排在临床诊断mm一年前，通常只是很少部分患者浆细胞可检出；而在临床表现为mm的患者中，它们可以很快在大部分患者中检出，提示其可能直接参与疾病的进展。

chiecchio等[13]针对1号染色体中1q21.1至1q31.3片段，予以pdzk1、cks1b及aspm基因监测，分别于2001年9月、2003年6月、2004年6月、2005年5月、2006年3月共取5份样本。

1p32.3-于前三份样本为阴性，而后两份分别为42%、82%；其中缺失主要在cdkn2c基因座周围。

该基因的缺失在mm患者中可检出15%，在mgus/smm患者中则罕见，且伴随改基因缺失的mm患者预后较差。

这些都提示该基因缺失与mgus/smm向mm进展机制有很大关联。

2.3.21p31-32缺失wj.chng等[14]通过双中心131名mm患者进行检测染色体组的“得失”（gains and losses），发现1p31-32可
能包括三个与预后相关的不连续的区域；而20p12.3-12.1可能包含两个。

经fish检测分析，1p31-32缺失与患者生存期缩短具有相关性（24.5月比40月，p=0.01）；而20p12区缺失则患者亦有生存期缩短趋向（26.3月比40月，p=0.06）。

进一步的分析指出，1p31-32对生存期的影响主要是缩短复发后存活时间，而对完全缓解期及平台期（无进展期）患者没有影响。

2.49p21异常
目前认为，9p21异常影响mm预后的主要因素为位于其上的p16基因，该基因有3个外显子，编码的蛋白质长15.8 kb，含156个氨基酸。

p16具有抑制cdk4、cdk6的活性，防止cdks与cyclind 结合的功能，进而阻止rb基因磷酸化及抑制转录因子e2f的解离，达到调控细胞增殖的目的。

p16失活的主要方式是5’cpg甲基化，约占40%～70%。

在mm s期中p16甲基化浆细胞（pc）计数常为无甲基化者的2倍；且p16甲基化水平通常与血浆β2-mg、c反应蛋白（crp）呈正相关[15]。

2.517p13-异常
抑癌基因p53可调控细胞周期，调节细胞凋亡与分化，而17p13的缺失导致p53基因的缺如，是浆细胞疾病进展的继发性改变。

该异常与侵袭性病程和短的生存期相关，其检出率各家报道不一。

chang等[16]采用cig-fish技术在20%的mm患者中检测到p53基因缺失，且在9例侵犯中枢神经系统的mm患者中检测到8例有p53
基因的缺失。

schop等[17]采用fish技术在15%的mm患者中检测到了p53基因的缺失。

3复合染色体异常
mm患者通常会出现多种染色体异常合并存在的情况，而并非仅单个染色体的缺失或易位。

常见的复合染色体异常主要有14q32/igh 基因重排伴13染色体的全部或部分缺失。

madoka等[8]通过对23例患者fish检测发现：14q23基因重排有10例（43.5%），其中
11q13/ccnd1 占5例、16q23/maf 4例、4p16/fgfr3 仅1例；该10例中有9例伴随13-/13q-。

13号染色体异常包括-13 7例（70%）、13q14- 2例（20%）。

他们认为mm患者中14q32基因重排与13号染色体异常具有很大的相关性。

laura chiecchio等[4]通过fish技术对400例新发mm患者染色体检测发现，至少有一种染色体数目或结构异常者达99%；其中13-占47%，igh基因重排占46%，16q23-占21%，t（11；14）易位占14%，t（4；14）易位占13%，超二倍体为57%。

t（4；14）易位患者中约40%合并13-。

国内也有类似的报道，如王迪等[18]对mm患者骨髓单个核细胞滴片进行fiction
检测，结果20例患者检出t（4；14）4例，t（11；14）6例，t （14；16）1例，p53缺失3例，13q缺失8例；其中具有一种以上染色体异常占80%（仅4例未检测出上述5种异常），两种或两种以上改变的占6例（30%）。

4讨论
4.1预后评估体系，指导临床个体化治疗
mm是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积累为特征的肿瘤，其自然病程个体差异较大，具有明显的疾病异质性。

所以建立完善的预后评估系统，为mm患者提供个体化治疗尤为重要。

传统的评估体系仅限于临床表现及血液学特征，如贫血、钙离子浓度、白蛋白及β2微球蛋白等角度去评估。

随着检测技术的进步及科研能力的提高，越来越多的基因水平异常被发现，且其中多数具有独立的预后价值，这无疑补充和完善了预后评估体系，为指导临床个体化治疗提供了依据。

总的来说，这些具有独立预后意义的染色体与基因异常所造成的根本改变是原癌基因与抑癌基因相互制约的失衡，这种失衡主要表现为原癌基因的过度表达或抑癌基因的缺失。

从层次上讲，可以分为主导地位的失衡和次要地位的失衡。

主导地位的失衡决定了mm
的发生、发展；而次要地位的失衡仅决定mm的预后。

greslikova 等[19]对68例新诊断mm病人进行细胞质的免疫球蛋白轻链标记联合fish技术检测遗传学异常，其中有53例存在染色体异常（78%）；进一步的随访发现有两个或更多染色体异常病人的整体存活率
（p=0.001）、进展时间性（p=0.036）和无进展存活率（p=0.008）明显缩短。

具体来说，14q32/igh基因易位所形成的融合基因过度表达，导致大量m蛋白的分泌，形成浆细胞瘤的生物学特性，但它往往不影响预后；而与它合并存在的染色体异常往往提示预后信
息，如伴有13-或13q-异常多预后较差，可能与13号染色体长臂上的抑癌基因rb1缺失有关。

与此类似的还有17p13-，这种染色体改变导致了p53基因的缺失，同样预后较差。

而某些三倍体（如+6、+9和+17）则预后较好，其与抑癌基因补偿性表达，从而部分代偿了这些mm患者的dna缺陷有关。

郑元等[20]用18号染色体探针和间期fish及时对22例mm患者进行检测，发现4例18号染色体异常，其中包括2例18号染色体三体及2例18号染色体单体。

2例三体生存期分别为2个月及14个月，而2例单体已随访21个月及32个月，表明18号染色体三体预后不良，而18号染色体单体预后较好。

这恰好说明18号染色体上基因的增减对预后的影响。

同时，染色体的检测可为处于平台期患者微小残留病（mrd）监测予以指导。

mrd是mm疾病进展和复发的根本原因。

因此，应用特异、敏感和快速的方法检测mrd具有重要的临床意义。

传统的mrd 指标的选择多为浆细胞表面高表达的cd分子，如：cd56、cd138等；但细胞表面分子的表达往往具有交叉性或因浆细胞瘤的染色体突
变使得细胞表面抗原分子的表达有所增减、缺失，因而未能准确反映体内残留浆细胞瘤的水平。

染色体的检测可提供具有典型生物学特征或具有重要预后意义的异常染色体作为检测指标，如14q32的重排、13-/13q-等，可行fish联合pcr技术对其动态检测，因其从基因组学的角度对浆细胞瘤进行检测，可更加准确地反映机体肿瘤负荷的变化，指导临床予以针对性治疗。

4.2建立假说，进一步阐述发病机制
mm属于浆细胞克隆性疾病，其发病机制尚不清楚。

通过对mgus、smm、mm的纵向比较及mm的染色体异常的综合分析，对其发病机制可以做出这样的推测，最初的遗传学改变使浆细胞克隆永生化，进一步的改变使其获得增殖优势，但仍受造血微环境调控，更进一步的改变使其不依赖造血为环境，发展为髓外mm。

即在机体表现mm 的临床特征之前，体内浆细胞染色体可能发生了两个方面的改变：其一，14q32的易位，目前发现该易位共涉及5个伙伴基因；其二，一些重要染色体的突变，如13-或其他染色体缺失。

但这并不能完全解释mm的发生机制，因为尚有部分mm患者并没有14q32/igh基因的重排，这可能与临床亚型及当前检测水平有限有一定关系，但同时也提示可能具有其他的一种或多种发病机理的存在，仍需进一步探索。

4.3为药物研发提供新靶点
mm仍是不可治愈的恶性疾病，现有水平的药物治疗方案已达最大治疗效应，且靶向治疗已成为mm最有效治疗手段之一。

随着靶向治疗的深入开展，靶点的探求成为靶向药物开发途径的关键点，而染色体检测则为突破这种瓶颈提供了有效途径。

o’neal等[21]应用新的矩阵比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，acgh）技术检测13号染色体长臂，于13q13及13q14
处发现两个最小缺损区间（minimally deleted region，mdr）。

walker ba等[22]经单个核苷酸多态性分析显示13q常累及13q13.3至13q21.3大约1.9mb大小mdr，分别为rb1及nbea基因。

他们发现位于13q13位置的nbea基因在mm患者多数为断裂表达，并由此认为nbea为一新的肿瘤抑制基因应予以进一步探索。

mm患者多有13q14.3缺失，其伴随着钾离子通道调节蛋白基因的缺损；而钾离子通道调节蛋白为潜在的肿瘤抑制因子，birerdinc等[23]推论其可能与mm的发病机制相关且可能为临床治疗提供新的靶点。

kcnrg 蛋白可能具有前体凋亡及抗增殖活性，高度同源性四聚体电压门控k离子通道调控蛋白（kcnrg）的单倍剂量的不足可能与cll及mm （至少部分亚型）的进展相关。

该蛋白可通过其四聚体结构域与钾离子通道蛋白结合，从而干扰钾离子的流通，进而发挥诱导细胞前提凋亡和（或）抑制细胞增殖作用。

此外，常见的t（4；14）易位能够导致fgfr23过度表达，最终激活sta t3，导致瘤细胞恶性增殖。

相关实验[24]发现靶作用于fgfr23酪氨酸激酶的药物pro-001，在体外对存在t（4；14）的骨髓瘤细胞有细胞毒作用，所以fgfr23 抑制剂有望成为治疗高危mm患者的一种新型药物。

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