真菌细胞破壁方法的研究

真菌细胞破壁方法的研究

摘要:用4种处理对真菌细胞进行破壁,使其释放出细胞内物质.处理后的菌液用血细胞计数板计数,得到每毫升菌液中的孢子数和菌体碎片数,观察比较机械破碎的效果.以可溶性蛋白为参照,通过蛋白质的SDS-PAGE分析,比较4种处理方法使细胞破壁后释放蛋白质效果的差异.结果表明,方法2的破碎效果和细胞可溶性蛋白质释放效果都较好,是一种首选真菌细胞破壁的方法.

关键词:真菌;破壁方法;可溶性蛋白; SDS-PAGE

Abstract: Four kinds of method for breaking fungus cell walls were used to release proteins in the fungi.The spore and fragment numbers in the germ solution dealed with the above methods were determined withblood corpuscle counting meter. With releasing soluble protein as example, the differences of releasingproteins by the four methods of breaking cell walls of fungus were analyzed with SDS-PAGE. The resultsshowed that the second method, i.e. breaking wall with ultrasonic and adding silica sand, appeared welleffect and it was the first selective means for breaking cell wall of the fungi.

进行细胞内含物的研究,如蛋白质、脂类、DNA和其他活性物质,都需要使细胞壁破碎,它们才能从细胞内释放出来,所以细胞壁破碎是细胞内物质提取和研究的基本步骤[1].真菌细胞壁较厚,结构坚韧,其破壁难度较细菌细胞大,适用于细菌细胞的破壁方法用于真菌细破壁往往效果不佳[1,2],因此我们对适用于真菌的破壁方法进行了一些探索.本文采用4种处理方法对真菌细胞进行破碎,通过对处理后的菌液进行血细胞计数板计数,得到每毫升菌液中残留的孢子数和菌体碎片数,对处理真菌细胞后得到的蛋白质进行SDS-PAGE分析,比较,确定真菌细胞最佳破壁方法.

1材料与方法

1.1样品制备

DS-9701菌株用土豆培养液于18℃暗培养3d.其中含1 mg/mlMgSO4, 4 mg/ml,KH2PO4, 2.860μg/ml H2BO3, 1.015μg/ml,MnSO4和5μg/ml,Vitamin.收集菌丝置于-70℃低温冰箱

中保存备用.分别取1 g菌丝加10 mmol/L的磷酸缓冲液10 ml.真菌细胞破碎采用4种处理:(1)加石英砂100 mg,研磨15 min; (2)加石英砂100 mg,超声波破碎[3]; (3)加石英砂100 mg,研磨2～3min成糊状,再超声波破碎; (4)超声波破碎,不加石英砂[4].对4种破壁方法处理后的菌液进行镜检并血细胞计数板计数,得到每毫升菌液中残留的孢子数和菌体碎片数,每一样品分别小格计数,取平均值,比较4种机械破碎效果. 4种样品分别离心(15 000 r/min,5 min);取上清液,加1倍丙酮(4℃)置于-20℃, 4 h.离心(15 000 r/min, 5 min);收集沉淀备用.用去离子水溶解蛋白质沉淀,加1倍体积2×上样缓冲液; 2×上样缓冲液含Tris(pH6.8)100 mmol、蔗糖40%SDS4%、溴酚蓝0.25%、β-巯基乙醇6%.样品煮沸5 min,点样电泳.

1.2电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统.浓缩胶(pH6.8)和分离胶(pH8.9),质量分数分别为5.0%和13.5%.上样量为每孔5μL,以溴酚蓝为指示剂.指示剂在浓缩胶中时,电压为100 V;进入分离胶后,电压增至200 V.电极缓冲液均为tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3),加质量分数为0.1%的SDS.电泳在4℃冰箱进行,停止电泳后,迅速进行固定染色[5].

1.3染色

染色采用银染色法,取出凝胶在体积分数为0.01%甲醛、体积分数为50%甲醇和体积分数为12%乙酸中固定1 h以上,用体积分数为50%乙醇冲洗4次,每次20 min;在质量分数为

0.02%的硫代硫酸钠中浸泡1 min左右,至胶由白色变透明;质量分数为0.2%硝酸银和体积分数为0.075%甲醛中渗透20 min;在质量分数为6%无水碳酸钠、体积分数为0.05%甲醛和质量分数为0.001%的硫代硫酸钠中显影10 min;体积分数为50%甲醇和体积分数为12%乙酸终止反应.

2结果与分析

2.1血细胞计数板计数结果

按照血细胞计数板标准使用方法进行取液和计数并进行计算,得到的每毫升菌液中残留的孢子数和菌体碎片数结果见表1.结果显示,4种处理方法对真菌菌丝的破碎效果都较好,即真菌的营养菌丝基本破碎,释放出内含物.抽样计数结果显示,菌体细胞经4种破壁方法处理后,菌液中孢子的残余数目不同,方法4>方法2>方法1>方法3.同时,菌液中残余的菌体碎片数也不同,方法3>方法1>方法2>方法4.这些说明,方法3处理真菌孢子,破碎效果最好,方法1较好,方法2次之,方法4最差.

表1 血细胞计数板技术结果

2.2菌体可溶性蛋白质SDS-PAGE

对同一种菌丝用4种破壁方法处理后得到的可溶性蛋白质进行SDS-PAGE,结果如图1.结果显示,对同一种菌丝用4种破壁方法处理后得到的蛋白质进行SDS-PAGE分析,方法2(B)的蛋白显带最多,也最清晰;其次是方法1(A),其蛋白显带也较多和较清晰;方法3(C)的蛋白显带比方法1和2的要少,但其蛋白显带也较清晰;方法4(D)其蛋白显带非常模糊,基本无法辨认,效果最差.由此可见,方法2处理真菌菌丝,使细胞内的蛋白质释放的效果最佳,且在操作过程中蛋白质性状较稳定,变性较少.方法1释放细胞内蛋白质的效果也较好.方法3释放细胞内的蛋白质的效果则不如方法2和方法1,也可能是其研磨时间过长,在此过程中蛋白质会有一些变性沉淀.方法4释放细胞内蛋白质的效果最差.实验操作中,以无离子水溶解蛋白质沉淀时发现,沉淀的溶解性不同,方法2>方法3>方法1>方法4,说明4种方法操作过程对蛋白质变性的影响不同[6].这也说明蛋白质变性程度顺序为:方法4>方法1>方法3>方法2.A-D:处理方法1～4所获可溶性蛋白质

3结论

从实验操作分析,在预实验中,采用方法1时,若研磨时间较短,由于真菌细胞壁坚韧,细胞破碎效果不佳,只有延长研磨时间,但研磨时间过长,操作稍有不慎,将造成细胞内含物变性,不宜用于易变性的细胞内含物的分析研究[6].方法3中经历了研磨和超声波破碎两个步骤,这种方法增加了实验操作程序,但没有明显增加可溶性蛋白质的含量和种类.方法2使真菌菌丝破碎和细胞内含物释放的效果都非常好,且操作时间短、操作简便,在操作过程中真菌细胞内含物(如蛋白质等)性状稳定,变性少.综合镜检真菌菌丝细胞破碎情况、血细胞计数板计数结果