酶学基本知识和技术

第四章酶学基本知识和技术

酶是活细胞产生的，并能在体内外起催化作用的一类特殊蛋白质。酶定量测定越来越多的应用与临床，而且在诊断、鉴别诊断上起着重要作用。

第一节酶活性测定的基本知识

在临床生化检验中，测定酶活力的方法，通常有两种：

1.在一定条件下，单位时间内，被酶作用的底物减少量或产物生成量。

2.在一定条件下，酶活力与反应所需时间成反比的关系。

一、酶活性的概念和单位

（一）酶活性的概念

在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶的活性。如果将酶反应中S或P对t作图，可得到酶反应时间进程曲线图。

在线性期S和P的变化量与时间呈线性关系：

V===K

一般情况下，产物的减少量和产物的增加量是一致的，但测定产物的生成比测定底物的减少好。

因为反应体系中底物往往过剩，而产物是从无到有的，只要方法灵敏，测定的准确度可以很高。所以，酶活性测定大多采用产物生成法。

（二）酶活性单位

是指在某特定条件下，使酶反应达到某一速度所需的酶量。有三种表示方法：

1.惯用单位：

大多是由方法的作者自己规定，在某一特定的条件下，生成一定量产物为一个单位。

所以不同的酶，甚至同一个酶，不同的测定可有不同的定义。如ALT测定，改良穆氏法、金氏法、赖氏法的单位定义各不一样。所以无可比性。

2.国际单位：

1964年国际生化协会所规定的国际单位（IU）：即规定实验条件下，每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。

如表示血清中酶浓度多以U/L表示之，即IL标本（血清）中含的酶量。我国医学界对此表示方法已经熟悉习惯。

缺点：①惯用单位换算国际单位麻烦。

②有些大分子量底物不明。

③同一种酶用不同的测定国际单位仍不相同。

3. Katal单位：

Katal，指在最适条件下，每秒能催化1摩尔底物发生变化的酶量为1个Katal 单位。 1U＝16.67μKatal（或1/60μKatal）。

二、酶活性的测定

酶活性测定中，一定要保证过量的底物，以保证反应是在线性期进行，酶活性测定分两种类型：

1.终点法：(end-point analysis)固定时间法：

先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加入试剂进行化学反应呈色测出底物和产物的变化。由于比色法灵敏度较低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分钟左右。

历史上这类方法常被命名为“终点法”、“二点法”、“固定时间法”和“取样法”。大多数文献使用“固定时间法”。此命名指出了用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。最基本一点的是此类方法停止反应后才测底物或物的变化。

优点：简便、比色时无需考虑保温，显色剂的选择，也不必考虑对酶的影响。缺点：无法了解酶作用的这一段时间是否在线性期。“固定时间法”测定时间长达

的要求。

30分钟，很难满足上述方法学上测定初速度V

图17-8 二点测定法中可能引起的误差

从图上看：1的反应速度已逐渐减小，2的反应速度逐渐开始增大，3的反应速度达线性期。

所以，采用终点法时，首先要测定酶反应的曲线，避开延滞期和非线性期。以及其他条件的影响。

★2.连续检测法：（continuous monitoring assay）(动力学法、速率法、连续反应法)

每隔一段时间（10～60秒）连续测定酶反应中某一产物或底物的变化量称为速率法。

定时法只测两个时间点，而速率法则进行多点连续测定，将这些点连成线，很容易找到线性期，在此段中计算酶活性，结果当然可靠准确。而且不需终止反应，是边反应边测定。但速率法要求检测仪器有恒温装臵，且底物和产物可直接测定。优点：省时、省试剂、省样品，对干扰不明显。可以不作空白，适用于自动分析。

缺点：反应速度受多种因素的影响。所以在反应中需严格控制反应条件（温度、PH底物浓度等）

（二）酶活性单位的计算：

此中ε为摩尔（线性）吸光体系（mol－1〃L〃cm－1）△A为吸光度变化v为标本体积（ml）V为反应体系体积（ml） L为光径（cm）在实际测定中后面几项皆为常数，所以上式常简化为：

三、影响酶活性测定的因素

（一）样品：

1.是否溶血？红细胞中某些酶活性比血浆高，如LDH红细胞中的活性比血浆中高150倍，ALT和AST红细胞比血浆高15倍和17倍。所以溶血后对这些测定有影响。但单氨氧化酶、CK红细胞缺乏，所以即使严重溶血，上述两酶不升高。

2.抗凝剂：某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA可抑制需钙离子的淀粉酶和需要镁离子的肌酸激酶等。所以，生化检验一般用血清标本，需用血浆时，也用肝素抗凝。

3.样品存放时间：

各种酶的稳定性不一样如前列腺测定的酸性磷酸酶，在室温下也迅速失活，尤其在碱性溶液中失活更快，37℃也失活，所以高热患者不能正确测定此酶活性。故对酶测定要注意其稳定性。

（二）测定条件

1.温度：酶的最适温度一般在35℃～40℃之间。

2.PH：主要是改变底物的解离状态，影响底物与酶的结合。改变酶活性中心基团的解离状态，影响酶活性。

3.缓冲液性质：选择缓冲液应注意①缓冲液中弱酸的pK应与要求的pH值相近；②缓冲液对酶活性无抑制；③在紫外可见光区没有或仅有少量光吸收现象。

4.底物浓度：要使反应速度v接近最大反应速度Vmax，一般设计［S］为10－20Km为宜，因为此时v达到Vmax的90％－95％。

5.酶浓度：［S］<<［E］，酶才能被［S］饱和，反应速度达最大值，所以当［S］过高时，应将标本适当稀释再加以测定。

6.激活剂：

7.抑制剂：

五、酶促反应底物动力学

酶促反应速度与底物浓度不成直线，而成双曲线关系，如图：