生物技术与人类生活(6)--蛋白质工程

8-02.4 蛋白质组学
蛋白质工程
部分医学科学重点研究领域 研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方 面，涉及白血病、乳腺癌、结肠癌和神经母细胞瘤等重 大疾病。
蛋白质工程
8-02.4 蛋白质组学
目前国内研究进展
重大疾病（如肝癌）、维甲酸诱导白血病细胞凋亡 启动模型。 维甲酸定向诱导胚胎干细胞向神经系统分化的蛋白 质组。 血清中筛选诊断重大疾病的标志物——人血清蛋白 质组学。 各类肿瘤疾病形成过程中,参与信号转导通道的蛋 白质组。
蛋白质工程
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系
同源蛋白质 指在不同的有机体中实现同一功能的蛋 白质，但这些同源蛋白质中的氨基酸序列存 在着种属的差异性。
结构域 多肽链之间以共价键方式连接 功能区域
蛋白质工程
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系
铁蛋白的分子结构是由铁核和蛋白质壳 组成的。 铁蛋白的隧道可分为电子隧道和物质交 换隧道，前者起着传递电子的作用，后者起 着物质交换的通道作用。 铁蛋白蛋白质壳通过柔性调节产生电子 传递现象。
8-02 蛋白质工程
学习目的 初步了解蛋白质结构，以及蛋白质分子 设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。 了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关 技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白 质更优良的蛋白质。
8-02 蛋白质工程
蛋白质工程
8-02.1 蛋白质结构基础
8-02.1.1 蛋白质结构的基本构件
蛋白质、核酸 、多糖和脂类等生物大分子的结构 与功能。
肽键结构
蛋白质工程
8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构
X Y Z 人 Thr Thr Ile 猪 Ala Thr Ile 牛 Ala Ala Val 图6-2 猪、牛和人的胰岛素的一级结构
8-02.1 蛋白质结构基础
蛋白质工程
6-02.1.2 蛋白质的高级结构 分子结构: 一级结构、二级结构、三级结构 和四级结构。 分子构象: 空间结构、高级结构、立体结构、 三维结构。 二级结构 :指多肽链主链骨架中的若干肽段，各 自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键 维系，从而形成有规则的构象。 α螺旋、β折叠和β转角
蛋白质工程
8-02 蛋白质工程
8-02.4 蛋白质组学
针对有关基因或转录组数据库的生物体 或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质 组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质 组学研究。 以重要生命过程或人类重大疾病为对象， 进行重要的生理/病理体系或过程的局部蛋 白质研究，即比较蛋白质组学研究 。 蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学 研究。
蛋白质工程
8-02.2.2 蛋白质的全新设计
天然的锌指多肽
FSD-1多肽(从头设计)
蛋白质工程
8-02.2 蛋白质工程的研究方法
8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构
分离纯化目标蛋白质。 分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三 维结构以及结构与功能的关系。 根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。 根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋 白质改造的目的设计改造方案。 对目的基因进行人工定点突变。 改造后的基因在宿主细胞中表达。 分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达 到设计目的。
蛋白质工程
8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略
蛋白质工程
8-02.2 蛋白质工程的研究方法
8-02.2.2 蛋白质的全新设计 8-02.2.2.1 设计目标的选择 蛋白质全新设计 功能设计、结构设计。 研究重点和难点 从结构设计出发，从蛋白质的二级结构 开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。
蛋白质工程
蛋白质工程 8-02.1.1 蛋白质结构的基本构建
8-02.1.1.1蛋白质的化学组成 基本元素: 有机元素: 碳、氢、氧和氮 无机元素: 碱金属、碱土金属 和重金属 蛋白质: 、胨、肽 氨基酸分类: 非极性R基氨基酸、不带电荷的 极性R基氨基酸 、带正电荷的R 基氨基酸 、带负电荷的R基酸性氨 基酸
8-02.3 蛋白质工程的应用实例
蛋白质工程
8-02.3.2 人白细胞介素-2 由133个氨基酸残基组成，共有三个半胱 氨酸。 二硫键的错误配对将降低其生物学活性 并对人具有抗原性。 用基因定点突变方法可将IL-2的125位 Cys改为丝氨酸（Ser）或丙氨酸（Ala），避 免错误配对的产生，而且其热稳定性等方面 也有较明显的改善。
蛋白质工程
8-02.2.3.2 PCR扩增法
重组PCR定点突变法示意图（引自吴乃虎，1998）
蛋白质工程
8-02.2.3.2 PCR扩增法
大引物诱变法示意图（引自吴乃虎，1998）
8-02 蛋白质工程
蛋白质工程
8-02.3 蛋白质工程的应用实例
8-02.3.1
胰蛋白酶
223个氨基酸残基和以异亮氨酸为N端的 单肽链。 Arg117位自溶点的缺失突变，得到缺 失突变体，其结果表明该突变体的稳定性 明显提高。 将酶分子表面的正电荷改变成负电荷， 以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa 值，在pH较高的条件下显示出对精氨酸具 有更高的专一性。
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8-02.2.3.1 M13载体法
M13载体法基因人工定点突变示意图（引自吴乃虎，1998）
蛋白质工程
8-02.2.3 改变蛋白质的现有结构
8-02.2.3.2
ＰＣＲ扩增法
该法的原理也是利用人工合成带突变 位点的诱变引物，通过ＰＣＲ扩增而获得 定点突变的基因。PCR定点诱变法可分为重 组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。
丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 Asn或Asp 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 Gln或Glu 甘氨酸 组氨酸
Ala Arg Asn Asp Asx Cys Gln Glu Glx Gly His
A R N D B C Q E Z G H
异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸
Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
I L K M F P S T W Y V
8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构
蛋白质工程
多肽链 :由许多氨基酸按一定的排列顺序通 过肽键相连而成。 酰胺键 :一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的 羧基缩合失去一分子水。
蛋白质工程 8-02.1.2 蛋白质的高级结构
α螺旋结构
β折叠结构
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8-02.1.2 蛋白质的高级结构
三级结构:在三维空间中沿着多方向进行卷 曲、折叠、盘绕而成的近似球形的 结构。 蛋白质构象作用力: R基之间的氢键 非极性R基之间的疏水基相互作用
α螺旋和β折叠中的肽链内或肽链间的氢键 带正负电荷的R基之间的离子键
蛋白质工程
8-02.1.1 蛋白质结构源自文库基本构建
8-02.1.1.2 氨基酸的物理性质
无色结晶 特殊晶型 溶点极高
两性离子形式存在 氨基和羧基 接受质子和释放质子 两性电解质
8-02.1.1 蛋白质结构的基本构建
蛋白质工程
8-02.1.1.3 蛋白质的一级结构 各种氨基酸的简写符号
名称 三字母符号 单字母符号 名称 三字母符号 单字母符号
8-02.1.2 蛋白质的高级结构
蛋白质工程
亚基 (三级结构) 一条多肽链组成。 数条多肽链组成，这些多肽链通常以 二硫键相连接成为亚基。 四级结构 亚基聚合而成 亚基之间非共价键结合 均一四级结构 非均一四级结构
8-02.1.2 蛋白质的高级结构
蛋白质工程
维持四级结构的主要力: 疏水键、氢键、离子键和范德华引力 常见的聚合体: 二聚体、三聚体、四聚体、五聚体， 最多可聚合成六十聚体
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系
蛋白质工程
A
铁蛋白分子结构图 A：蛋白质壳； B： 铁核； C：三相物质交换隧道
蛋白质工程
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系
protease inhibitor-proteasecomplex
inhibitor 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)抑制蛋白酶活性的途径与机理
8-02.1 蛋白质结构基础
蛋白质工程
8-02.1.3 蛋白质分子之间的相互作用
蛋白质工程 8-02.1.3 蛋白质分子之间的相互作用
铁蛋白
钼铁蛋白 钼铁蛋白和铁蛋白相互作用示意图(引自Schlessman et al.)
蛋白质工程 8-02.1 蛋白质结构基础
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特 定的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对 特定功能而言是必需基团，另一些是非必 需基团。 在体内，蛋白质分子是如何利用它的特定 结构执行特定的生物功能的。
蛋白质工程
8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构
改变蛋白质结构的核心技术
基因人工定点突变技术 M13载体法 PCR扩增法
蛋白质工程
8-02.2.3 改变现有蛋白质的结构
8-02.2.3.1 M13载体法
该法的原理是利用人工合成带突变位 点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体 载体系统合成突变基因。
蛋白质工程
8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略
蛋白质工程的主要研究手段: 利用所谓的反向生物学技术，其基本 思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸 序列，通过计算机设计，进而模拟特定的 氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行 多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测 蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的 可能及其高低程度。
8-02.1.4 蛋白质结构与功能的关系
蛋白质工程
模拟核小体分子
8-02
蛋白质工程
蛋白质工程
8-02.2 蛋白质工程的研究方法 8-02.2.1 蛋白质工程的研究策略 蛋白质工程的基本途径： 从预期功能出发，设计期望的结构，合 成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定 向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良 蛋白质。
8-02.2.2 蛋白质的全新设计
8-02.2.2.2 蛋白质设计技术与方法
常用的蛋白质设计思路 是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预 期目标是否吻合。 是否具有预定的三级结构。圆二色谱和核磁 共振技术可用于研究蛋白质。 是否以单分子或多聚体形式存在。三级结构 测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。体积排 阻色谱法也可以用于判断分子体积大小、聚合体 数目和蛋白质结构是处于无规则状态或三级结构 等生化参数。
蛋白质工程
8-02 蛋白质工程
复习思考题 • 简单叙述蛋白质结构的基本组件。 • 简述氨基酸的基本理化性质。 • 简单描述反向生物学的途径。 • 举例说明对现有蛋白质进行改造的主要方 法及其应用。 • 什么是蛋白质组学？
蛋白质工程
8-02 蛋白质工程
主要参考文献 1．沈同，王镜岩，赵邦悌. 1980. 生物化学（上，下册）.北京：高等教 育出版社 2. 王大成. 2002.蛋白质工程. 北京：化学工业出版社 3.Pennington SR，Dunn MJ. 2001. Proteomics: from Protein Sequence to Funcation. New York:BIOS Scientific Publisher Limited 4.沈仁权，顾其敏，李泳裳等. 1980.基础生物化学. 上海：上海科学技术 出版社 5.M.R.坎普等著. 2000. 蛋白结构分析：制备、鉴定与微量测序.施蕴渝， 饶子和，陈常庆译.北京：科学出版社 6.夏其昌. 1997.蛋白质化学研究技术与进展. 北京：科学出版社 7.何美玉. 2002.现代有机与生物质谱. 北京：北京大学出版社 8.T.A. B布朗. 2002. 基因组.袁建刚，周严，张伯勤译.北京：科学出版社 （ 黄河清 编写）