第6章-分子生物学研究法(下)讲解学习
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3
原理：根据理论上任何长度超过9～10(49=262144) 个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序 列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分 离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的 核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克 隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对 应编码基因的表达频率。
16
体外定点突变的具体方法有三种：
（1）寡聚核苷酸介导的定点突变； （2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）； （3）大引物诱变法。 以上三种方法虽不同，但原理都一致。
17
1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术
已知序列的环状DNA 变性
定点突变
模板
人工合成一段引物
DNA聚合酶
延伸诱变寡核苷酸引物
细菌转化
13
• 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具 有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色 等特点
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
14
荧光素标记探针DNA
染色体
DNA
检测荧光素来确定与探针 DNA序列杂交的互补序列在
4
SAGE程序:
提取总RNA 以与生物素相连的寡聚dT为引物
分离提取mRNA
逆转录合成cDNA
4bp碱基的锚定酶（AE）
分离与抗生物素及微磁球
相连的3 ′端cDNA
5
3 ′端cDNA分两份 分别与连接子1和连接子2连接
标签酶（TE）切割 含有9－14个碱基的标签
DNA聚合酶(Klenow)补平 标签1 标签2
染色体或DNA上的位置
荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA
荧光原位杂交显示的端粒
15
6.1.4 定点突变技术
➢定点突变（site－directed mutagenesis）是重组 DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点 核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于 研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催 化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新 的酶切位点等。
22
单一基因 易错PCR
DNA随机突变库 随机片段化
随机片段库 重聚PCR 突变和重组基因 随机重组库
检测正突变重组子
正突变表型 负突变表型
检测负突变重组子
23
6·2·2 基因敲除技术
概念：
基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶 （gene targeting）。这种技术是通过基因工程的方 法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其 他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从 整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这 种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失 的技术称为基因敲除技术。
6
6·1·2 RNA选择性剪切
RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选 择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产 生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接 使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因 表达多样性的重要表现形式。
9
平衡剪切
类型
5′选择性剪切 3 ′选择性剪切
外显子遗漏
5′ss
3′ss
反向引物 （R1）
正向诱变 引物（M）
PCR1产物 双链大引物 退火和野生型基因复性
正向引物（F2） PCR2
全长突变DNA片段
退火温度PCR2>PCR1
20
非定点突变
（1）易错PCR技术为代表的无性进化
无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突 变，制造突变酶库以便筛选
易错PCR在采用Taq酶进行PCR扩增目的基 因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子 浓度，改变dNTP的浓度等，改变Taq酶的突 变频率
21
（2）DNA改组技术为代表的有性进化
DNA改组又称为有性PCR，基本操作过程是从 正突变基因库中分离出来的DNA片段用酶随机 切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR 循环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行 扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基 因的片段重组。
该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能组合 在一起，最终酶分子某一性质进一步进化。
筛选引入突变的环状DNA 18
2、重叠延伸技术
已知序列DNA模板
反向 引物
正向
反 向
反向
互
诱变 补 诱变
正向 引物
引物
引物
R2
FM P RM
F2
产物 1 C 2 产物
R
在重叠区发生退火
PCR3 形成全长双链突变DNA
使用引物F2和R2扩增 PCR4
全长突变DNA片段 19
3、大引物诱变法
已知序列DNA模板
5′ss 5′ss
3′ss
5′ss
3′ss 3′ss
5′ss
3′ss
相互排斥剪切 5′ss
3′ss
10
提取不同组织的总RNA
分离mRNA
检
RT-PCR
测
cDNA
方
以两端特异序列设计引物
法
PCR
观察PCR产物大小是否存在差异Leabharlann Baidu
存在差异
不存在差异
有选择性剪切
无选择性剪11切
6·1·3 原位杂交技术
➢原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）是 用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检 测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核 酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 ➢分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。
基因功能研究技术
1
分子生物学研究方法（下）
基因功能研究技术
2
6·1 基因表达研究技术
6·1 .1 基因表达系列分析技术
基 因 表 达 系 列 分 析 技 术 （ serial analysis of gene expression，SAGE）是一种以测序为基础定量分析 全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类 型细胞或组织的基因表达信息。
24
基因打靶的必备条件
• 打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。 同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要 有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就
12
荧光原位杂交技术 FISH （fluorescence in situ hybridization）
• FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱 基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进 行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线 性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交 从而将特定的基因在染色体上定位。
原理：根据理论上任何长度超过9～10(49=262144) 个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序 列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分 离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的 核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克 隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对 应编码基因的表达频率。
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体外定点突变的具体方法有三种：
（1）寡聚核苷酸介导的定点突变； （2）双引物法定点突变（重叠延伸技术）； （3）大引物诱变法。 以上三种方法虽不同，但原理都一致。
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1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术
已知序列的环状DNA 变性
定点突变
模板
人工合成一段引物
DNA聚合酶
延伸诱变寡核苷酸引物
细菌转化
13
• 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具 有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色 等特点
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
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荧光素标记探针DNA
染色体
DNA
检测荧光素来确定与探针 DNA序列杂交的互补序列在
4
SAGE程序:
提取总RNA 以与生物素相连的寡聚dT为引物
分离提取mRNA
逆转录合成cDNA
4bp碱基的锚定酶（AE）
分离与抗生物素及微磁球
相连的3 ′端cDNA
5
3 ′端cDNA分两份 分别与连接子1和连接子2连接
标签酶（TE）切割 含有9－14个碱基的标签
DNA聚合酶(Klenow)补平 标签1 标签2
染色体或DNA上的位置
荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA
荧光原位杂交显示的端粒
15
6.1.4 定点突变技术
➢定点突变（site－directed mutagenesis）是重组 DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点 核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于 研究某个（些）氨基酸残疾对蛋白质的结构、催 化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA调控元件特征序列、维修表达载体、引入新 的酶切位点等。
22
单一基因 易错PCR
DNA随机突变库 随机片段化
随机片段库 重聚PCR 突变和重组基因 随机重组库
检测正突变重组子
正突变表型 负突变表型
检测负突变重组子
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6·2·2 基因敲除技术
概念：
基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶 （gene targeting）。这种技术是通过基因工程的方 法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其 他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从 整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这 种人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失 的技术称为基因敲除技术。
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6·1·2 RNA选择性剪切
RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选 择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产 生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接 使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因 表达多样性的重要表现形式。
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平衡剪切
类型
5′选择性剪切 3 ′选择性剪切
外显子遗漏
5′ss
3′ss
反向引物 （R1）
正向诱变 引物（M）
PCR1产物 双链大引物 退火和野生型基因复性
正向引物（F2） PCR2
全长突变DNA片段
退火温度PCR2>PCR1
20
非定点突变
（1）易错PCR技术为代表的无性进化
无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突 变，制造突变酶库以便筛选
易错PCR在采用Taq酶进行PCR扩增目的基 因时，通过调整反应条件，例如提高酶离子 浓度，改变dNTP的浓度等，改变Taq酶的突 变频率
21
（2）DNA改组技术为代表的有性进化
DNA改组又称为有性PCR，基本操作过程是从 正突变基因库中分离出来的DNA片段用酶随机 切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR 循环，循环过程中随机片段互为模板和引物进行 扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基 因的片段重组。
该策略将亲本基因群中的优势突变尽可能组合 在一起，最终酶分子某一性质进一步进化。
筛选引入突变的环状DNA 18
2、重叠延伸技术
已知序列DNA模板
反向 引物
正向
反 向
反向
互
诱变 补 诱变
正向 引物
引物
引物
R2
FM P RM
F2
产物 1 C 2 产物
R
在重叠区发生退火
PCR3 形成全长双链突变DNA
使用引物F2和R2扩增 PCR4
全长突变DNA片段 19
3、大引物诱变法
已知序列DNA模板
5′ss 5′ss
3′ss
5′ss
3′ss 3′ss
5′ss
3′ss
相互排斥剪切 5′ss
3′ss
10
提取不同组织的总RNA
分离mRNA
检
RT-PCR
测
cDNA
方
以两端特异序列设计引物
法
PCR
观察PCR产物大小是否存在差异Leabharlann Baidu
存在差异
不存在差异
有选择性剪切
无选择性剪11切
6·1·3 原位杂交技术
➢原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）是 用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检 测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核 酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 ➢分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。
基因功能研究技术
1
分子生物学研究方法（下）
基因功能研究技术
2
6·1 基因表达研究技术
6·1 .1 基因表达系列分析技术
基 因 表 达 系 列 分 析 技 术 （ serial analysis of gene expression，SAGE）是一种以测序为基础定量分析 全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类 型细胞或组织的基因表达信息。
24
基因打靶的必备条件
• 打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。 同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要 有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就
12
荧光原位杂交技术 FISH （fluorescence in situ hybridization）
• FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱 基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进 行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线 性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交 从而将特定的基因在染色体上定位。