14经典液相色谱法2-平面色谱分析(1)全解

18.5.3 定性和定量分析
• 定性分析
依据：Rf值。
用已知标准物质作对照，在多种展开系
统中比较Rf值的大小。
或与其它分析方法联用。
• 定量分析 洗脱法 用溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用
适当的方法进行定量测定。
斑点需预先定位。
直接定量法：
目视比较法：
将一系列已知浓度的对照品与试样溶液 点在同一薄层板上，展开并显色后，…
流动相：不与水相混溶的有机溶剂。或可与
水混溶的溶剂。
分离原理：
纸色谱法可以看成是溶质在固定相和流
动相之间连续萃取的过程。依据溶质在两相 间分配系数的不同而达到分离的目的。常用 比移值Rf来表示各组分在色谱中的位置。
Rf值与化学结构的关系
化合物极性大或亲水性 强 分配系数大 R f 值小（水为固定相）
tR L / u u0 Vs 1 K t 0 L / u0 u Vm
（等距展开）
l ut u 在薄层色谱中 Rf （定时展开 ) l0 u 0 t u 0
可知 1 Rf Vs 1 k 1 K Vm 1
1 Rf Vs 1 k 1 K Vm
1
K 或k R f
鼠李糖
表： 三种六碳糖的Rf值 溶剂系统
糖
1 葡萄糖 鼠李糖 洋地黄毒糖 溶剂系统 0.03 0.27 0.58
1.正丁醇－水
2 0.17 0.42 0.66
3 0.10 0.44 0.88
3.乙酸乙酯－吡 2.正丁醇－乙酸 啶－水（25：10： －水（4：1：5） 35）
18.6.2 纸色谱法的实验条件 色谱纸的选择 a.要求滤纸质地均匀，应有一定的机械强度。 b.纸纤维的松紧适宜。 c.纸质应纯，杂质量要小，无明显的荧光斑点。 薄纸定性，厚纸制备或定量。 Rf值相差小 大 慢速滤纸 快速滤纸
SN l0 / b0 b1 1 其中，b0、b1为R f 0和1时组分的半峰宽， 二者由外推法获得。
SN越大，说明板的容量越大。
18.5 薄层色谱法
• 主要类型
吸附薄层色谱法 正相色谱法 分配薄层色谱法 反相色谱法 分子排阻色谱法
18.5.1 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
• 吸附剂 最常用的是硅胶、氧化铝、聚酰胺、纤维素、 葡聚糖、磷酸钙、磷酸镁、硅酸钙镁等。 硅胶： SiO2· H 2O 结构： 内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→吸附活性中心→ 氢键作用
锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫
外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
购买时注意：
规格（主要是种类、活度级别和粒度） 常规：10～40μm 高效：5μm或10μm
氧化铝
碱性氧化铝、 中性氧化铝、酸性氧化铝
使用时可不加黏合剂，也可加煅石膏或 CMC等黏合剂； 通常使用活性级别Ⅱ～Ⅲ级。
• 展开剂
常见溶剂的极性由强到弱的顺序：
水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮> 乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯> 三氯乙烷>四氯化碳>环己烷>石油醚
如何选择吸附剂和展开剂？
用“竞争吸附”解 释
防止吸附太牢，Rf太小 被分离物质 的极性 大 小 吸附剂 的活度 小 大
展开剂极性
大 小 防止Rf太大
Rf 原点到组分斑点质量中 心的距离 原点到溶剂前沿的距离 l l0
l1 如图：A物质的R f l0 l2 B物质的R f l0
R f 值的范围为 0 R f 1 ， 常用范围0.2～0.8，最佳范 围0.3～0.5。
相对比移值Rr
Rr R f（被测） R f（参）
l被测 原点到组分斑点质量中 心的距离 原点到参考物斑点质量 中心的距离 l参
讨论 可消除系统误差，提高重现性和可靠性； 相对比移值范围可以大于或小于1。
• 相平衡参数 推导比移值与分配系数的关系 已知色谱过程方程：
Vs t R t 0 (1 K ) Vm
假设溶剂流动的速度为 u 0，溶质流动的速 度为u，则对于一根长度为 L的色谱柱，溶剂 流出的时间为 L / u 0，溶质流出的时间为 L / u，
表：TLC与HPTLC的比较 参数 TLC HPTLC
板尺寸(cm)
颗粒直径(μm)
颗粒分布
点样量(μl)
有效塔板数
展开距离(cm) 展开时间(min) 最小检测量：吸收(ng) 荧光(pg)
20×20 10 ~ 40 宽 1~5 >600 10 ~ 15 30 ~ 200 1~5 50 ~ 100
吸附薄层色谱法
分配薄层色谱法
分子排阻色谱法
纸色谱法：
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、 展开、定性、和定量的液-液分配色谱法。 20世纪40年代 产生
应用于生化医药学方面的微量分析。
20世纪60年代后，
应用减少。
薄层电泳法 带电荷的被分离物在纸、醋酸纤维素、 琼脂糖凝胶及聚丙稀酰胺凝胶等惰性介质 上，向与其相反的电极方向，以不同的速 度迁移而实现分离。
18.5.2 薄层色谱操作方法 可分制板、点样、展开和显色四个步骤。 • 薄层板的制备 软板的制备 硬板的制备 硬板加了粘合剂，常用的粘合剂有羧甲基 纤维素钠(CMC-Na)和锻石膏(CaSO4· 1/2H2O) 两种。
硅胶-CMC板制备
取羧甲基纤维素钠5~7g,加1000ml水，
加热使溶解，放置澄清，取上清液100ml,分
固定相： 纸纤维吸附的水
滤纸纤维有较强的吸湿性，通常含 20%~25%的水。其中有6%~7%的水是以氢键 缔合的形式与纤维素上的羟基结合在一起。 一般条件下较难脱去。所以为固定相。纸纤
维是一个惰性载体。
在分离一些极性较小的物质，为了增加 其在固定相中的溶解度，常用甲酰胺或二 甲基甲酰胺、丙二醇等作为固定相。分离 酸、碱性物质，常将纸条浸过缓冲溶液。
展开剂的选择 选择依据：根据被分离物质在两相中的 溶解度和展开剂的极性来考虑。 在流动相中的溶解度较大的物质将会移 动得快，具有较大的比移值；对极性物质， 增加展开剂中极性溶剂的比例，可以增大比 移值，增加非极性溶剂的比例，可以减少比 移值。
常用展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、
化合物极性小或亲水脂 强 分配系数小 R f 值大（水为固定相）
化合物的极性应根据整个分子及组成分子
的各个基团来考虑。
CHO HC OH
CHO HO CH HO CH HC OH
HC OH CH3
CHO
CH2 HC OH
HO CH
HC OH HC OH CH2OH 葡萄糖
HC OH
HC OH CH3 洋地黄毒糖
10×10 5,10 窄 0.1~0.2 >5000 3~6 3 ~ 20 0.1 ~ 0.5 5 ~ 10
18.6 纸色谱法
18.6.1 纸色谱法的分离原理
paper chromatography ～是以纸为载体的色谱法，分离原理
属于分配色谱的范畴。 固定相：纸纤维上吸附的水分。(或甲酰胺、
缓冲液等滤纸可以吸留的物质。)
平面色谱法
18.4.1 平面色谱法的分类 • 定义和分类 平面色谱法(plane chromatography)是在平 面上进行分离的一种色谱方法，主要包括
薄层色谱法、纸色谱法和薄层电泳法。
薄层色谱法：
将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。 按分离原理又可分为：
次加入硅胶约33g,调成糊状。去除气泡后，
将糊状的吸附剂倒在清洁的玻璃板上，使均
匀涂布于整块玻璃板上，平放自然晾干，
105℃活化1h，置干燥器中保存备用。
点样 a.样品溶液的制备 一般选用易挥发，与展开剂极性相似的 有机溶剂，如甲醇、丙酮、乙醇等。配制样 品液浓度为0.01% ~ 0.1%。 目的：使点样后溶剂能迅速挥发，减少色 斑的扩散。
R 2l2 l1 / W1 W2 2d / W1 W2
l2、l1分别为原点至两斑点中 心的距离， d为两斑点中心间的距离 ，W1、W2为斑 点的宽度。
分离数
定义在相邻斑点分离度 为 1.177 时，在 R f 0和R f 1两种组分斑点之间能容 纳的 色谱斑点数。
薄层扫描法： 用一定波长、一定强度的光束照射薄层 上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度 的变化，从而求得物质含量的方法。精密 度为±5%。 双波长型薄层扫描仪 测定方法：透射法和反射法。 扫描方法：线形扫描和曲折形扫描
L λ1 CH PM λ2
P PM
双波长薄层扫描光学线路示意图
18.5.4 高效薄层色谱法 (high performance thin layer chromatography；HPTLC) 高效薄层色谱的分离效率比经典薄层色谱提 高三倍，每分钟可分离5个以上组分，最多可分 离40种组分。检出灵敏度提高，分析时间缩短。 高效薄层色谱法与经典薄层色谱法在吸附剂 粒度等方面不同。
b.点样量和点样工具 点样毛细管，微量注射器 点样量一般以几微升为宜，毛细管大约
1cm左右。点样斑点直径以2~4mm为宜。
c.点样方法 吸取一定量的样液，轻轻接触于薄层的 点样线上，点样线一般距薄层底边 1.5~2cm， 点间距约0.8~1.5cm(新药典规定为1.5~2.0
cm)。点样后形成的原点面积越小越好，一
开展实验时，可以选用单一溶剂展开，再
根据Rf的大小，进一步调整展开剂的种类或
选用二元、三元展开剂。
分离酸性物质，可在展开剂中加入少量酸
性溶剂，如甲酸、乙酸等 分离碱性物质，可在展开剂中加入少量碱 性溶剂，如氨水、乙二胺等。
例如：用氯仿展开时，如果Rf值太小，则 大 的展开剂，如_____ 乙醇 。如 可加入极性___ 小 的展开剂， 果Rf值太大，可加入极性____ 环己烷、石油醚 。 如_______________
实际情况比上面分析的要复杂的多。总之， 薄层色谱过程中展开剂的流速是空间、时
间的复杂函数。
显色
显色方法：
a.在日光下观察，划出有色物质的斑点
位置。
b.在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点，
并记 录颜色、位置、强弱。能发荧光的物质
或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。
c.荧光薄层板检测。 d.显色剂显色。适用于无色，又无紫外吸 收的物质。薄层色谱常用的通用型显色剂 有碘、硫酸溶液、荧光黄溶液等。
• 薄层色谱法的特点： 分离能力强，斑点集中。 灵敏度高，几微克，甚至几十纳克的物 质也能检出。 展开时间短，一般只需十至几十分钟。 一次可以同时展开多个试样
试样预处理简单，对被分离物质性质没
有限制。
点样量较大，可点成点或条状。
所用仪器简单，操作方便。
18.4.2 平面色谱法参数
• 定性参数
比移值
展开剂的流速Uf
设展开剂前沿移动的距 离为 L0，所用时间为 t， 据测有： L0 kt 或 L kt
2 0
对L 0求导： dL 0Leabharlann Baidu1 1/ 2 1/ 2 k Uf k t dt 2 2L 0
可见， U f 随L 0变长而变慢，并与 k有关。 k 2k 0 d p cos k 0为渗透常数， d p为平均颗粒直径， 为 展开剂表面张力， 为展开剂粘度， 为展开 剂与固定相两相间的接 触角。
般原点直径不超过2~4mm为宜。
展开和展开剂的流速
展开 先预饱和。展开前，将薄层板置于盛有展 开剂的色谱缸内饱和15～30min,此时薄板不与 展开剂直接接触，当色谱缸内展开剂蒸汽、薄 层与缸内大气达到动态平衡时，即饱和时，再
将薄层板浸入展开剂中，称预饱和。
边缘效应： 指点在薄层板上的同一物质，薄板边缘的 Rf值高于中部的Rf值的现象。
表：硅胶的活度与含水量
硅胶含水量％
0 5 15 25 38
活性级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
氧化铝含水量％
0 3 6 10 15
适用范围： 硅胶表面的 pH 约为 5 ，适合分析酸性或 中性物质。 硅胶的类型： 硅胶H： 不含黏合剂，铺成硬板需另加粘合剂。 硅胶G： 是硅胶和锻石膏混合而成。
硅胶GF254：含锻石膏和无机荧光剂，即
K趋近0，Rf 趋近1，组分不被固定相 保留。 K趋近∞，Rf趋近0，组分停留在原点，
完全被固定相保留。
讨论 Rf 与 K 有关，即与组分性质（溶解度） 以及薄层板和展开剂的性质有关。 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关， 是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色
谱保留行为。
• 分离参数 分离度