白酒微生物的检测与鉴定

第二章白酒微生物的检测与鉴定

第一节白酒微生物的检测

白酒微生物可以分为有益菌和有害菌，这里所说的有益菌和有害菌，是因不同种类的白酒及其生产过程中的各个阶段，相对而言的。每种菌在生长的同时，往往可以产生以某一种酶为主的多种酶，这些酶将培养基中的成分分解或合成各种产物，并合成菌体成分。

一、有益菌的检测

有益菌主要有糖化菌和包括产香味菌在内的发酵菌两大类。糖化菌最好是能耐高温、耐酸、耐酒精且产糖化酶较多，产蛋白酶适量而不产果胶酶的菌；发酵菌主要生成适量的酒精及各种香味成分。

（一）霉菌

首先，曲霉和根霉是主要的糖化菌。其中黑曲霉的糖化力较高；根霉也具有较高的糖化力，且不产转移葡萄糖苷酶，并能产生多种有机酸，若与其它菌株配合使用，则有利于麸曲白酒口味的改善；白曲（霉）的糖化力稍低，但所制得的成品酒风味较好；米曲霉的糖化力较低，且不耐酸，但液化力及蛋白质分解力较强，一般用于制米曲汁的米曲培养。许多名酒大曲中，大多能分离到红曲霉及拟内孢霉，它们均有较好的产糖化酶能力。红曲霉也能产多种有机酸，并能分泌酯化酶；拟内孢霉能产多元醇，有利于增强白酒的绵甜感。少数犁头霉也有较高的糖化力。木霉能产纤维素酶，若菌株优良且培养的得当，并与其他糖化力高的菌株一起使用，则能提高出酒率。

关于有益霉菌的检测，主要是对霉菌孢子数的测定，可采用镜鉴法，也可采用下述的摇落孢子数法：称取种曲10g，烘干后摇落其孢子，经筛孔直径为0.2mm的筛子，求得干孢子与干物质的百分数。

另外，采用血球计数板在显微镜下直接计数的方法是一种常用的细胞计数方法。此法是将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室中的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。具体方法如下：

1、实验材料

①样品种曲霉菌。

②仪器和器具载玻片、盖玻片、旋涡均匀器、血球计数板、电子天平、显微镜、接种

环、酒精灯、恒温摇床。

③试剂95％酒精、稀硫酸(1：l0)。

④培养基察氏液体培养基。

2、实验方法与步骤

（1）样品稀释

精确称取种曲1g (称准至0.002g)，倒人盛有玻璃珠的250mL三角瓶内，加入95％酒精5mL、无菌水20mL、稀硫酸(1:10)10mL，在旋涡均匀器上充分振荡，使种曲孢子分散，然后用3层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，使滤渣不含孢子，最后稀释至500mL。

（2）制计数板

取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴，滴于盖玻片的边缘处(不宜过多)，让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。

（3）观察计数

用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。

使用16×25规格的计数板时，只计板上4个角上的4个中格(即100个小格)，如果使用25×16规格的计数板，除计4个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目(即80个小格)。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。

（4）计算

对于16×25的计数板：

孢子数（个／g）=(n/100)×400×10 000×（V／m）＝4×104×（nV／G）

式中：n为100小格内孢子总数（个）；V为孢子稀释液体（mL）；m为样品质量（g）。

对于25×16的计数板：

孢子数（个/g）=(n/80)×400×10 000×（V／m）＝5×104×（nV／m）

式中：n为80小格内孢子总数（个）；V为孢子稀释液体（mL）；m为样品质量（g）。

（5）结果记录计算

样品稀释至每个小格所含孢子数在10个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。

结果记入下表。

孢子数／

计算次数各中格孢子数小格平均孢子数稀释倍数

平均值

（1/g）

第一次

第二次

（二）酵母

酿酒酵母、产酯的异常汉逊酵母、球拟酵母均为有益酵母。对于酵母的检测，可以有如下方法：

1、酵母菌发酵力的测定

（1）原理

大曲、小曲是糖化、发酵剂。其中的酵母能使酒醅中的还原糖发酵，生成酒精和二氧化碳，反应式为：

发酵

C6H12O62C2H5OH+2CO2

所以可以使用在一定条件下制备的糖化液为培养基，测定发酵中生成的CO2量，以衡量曲为发酵力。

（2）仪器

带发酵栓、容量为250mL。

（3）试剂和溶液

①硫酸溶液5mol/L（1/2硫酸）。取14mL浓硫酸，边搅拌边缓缓加入50mL水中，用水稀释至100mL，不必标定。

②0.1碘液0.2mol/L碘液。不用标定

（4）糖化液的制备

取大米、玉米面或薯干淀粉原料50g，加水250mL，混匀，蒸煮1-2h，使呈糊状。冷却到60℃.加入原料量15%的大曲或小曲粉，再加入50mL预热到60℃的水，搅匀。在60℃糖化3-4h，至取出1滴与碘不嫌蓝色位置。加热到90℃，用白布过滤，滤液备用。

（5）灭菌

用150mL糖化液与250mL发酵瓶中，赛上棉塞并包上油纸，记录液面高度。同时用油纸包好发酵栓，一起放入灭菌锅中，在98kPa下灭菌15min。

（6）发酵、测定

灭菌后的糖化液冷却到25℃左右时，在无菌条件下加入曲粉1g，发酵栓中加入

10mL5mol/L硫酸。用石蜡密封发酵瓶，擦干瓶外壁，在千分之一感量的天平上称量。然后，放入25℃保温箱中发酵48h。取出发酵瓶，轻轻摇动，是二氧化碳全部逸出，在同一天平上再称。

发酵力（以二氧化碳的质量分数计，g/100g）=(m1-m2)*100/m

式中m1——发酵前发酵瓶中加内容物质质量（g）；m2——发酵后发酵瓶中加内容物质质量（g）；m——曲样质量（g）

2、酵母菌死灭温度的测定

经液态培养基培养的酵母菌，在10min即被杀死的温度，成为该菌的死灭温度。若死灭温度较高，则往往混有野生酵母。若死灭温度发生变化，则说明酵母不纯或发生变异。

在3支无菌的5mL麦芽汁试管中加入用麦芽汁培养24h的酵母悬液0.1mL。其中1支试管插入温度计，另外两只不插。将3支试管浸入40℃水浴中保温。待插温度计的试管温度达到40℃时，即开始计时，10min后立即取出，放入冷水中冷却。同法作42℃、44℃……至60℃试验。再将各组试管置入25℃的保温箱中，在7天内无发酵现象的最低温度，即为该酵母的死灭温度。但通常在这最低温度的基础上再加1-2℃，作为该酵母菌的真正死灭温度。

3、酵母菌耐酒精浓度的测定

酿酒酵母在糖化液中发酵至一定的酒精浓度，就停止发酵。每株酵母能忍耐的最高酒精浓度，是检验其特性的一个重要指标。

（1）材料

①酿酒酵母曲汁或麦芽琼脂斜面试管菌株。

②10°Bx曲汁或麦芽汁

③10mL V字型发酵管7支，无菌的2mL及10mL刻度吸管个1支，酒精灯，接种环，无水酒精。

（2）操作

在各发酵管中按下表加入曲汁或麦芽汁，在100kPa蒸汽下灭菌20min后，再于无菌条件下加入无水酒精，静置2天，使酒精扩散均匀。