嗜盐细菌XJ12的分子鉴定与生长特性研究
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发利用。 １ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
７ ２ 延伸 １ ０ ａｉ ｒ ｎ 。Ｐ Ｃ Ｒ产物 ４℃保存 。 １ ． ２ ． ４ Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物胶回收 存备用 。 １ ． ２ ． ５ 与ｐ Ｍ Ｄ１ ８一 Ｔ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 连接和转 化 按 照宝生物 工程
（ 大 连） 有限公司 Ｐ Ｃ Ｒ产 物克 隆用载体 ｐ ＭＤ １ ８一Ｔ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 试
中图分 类号 ： Ｘ １ ７ ２ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） １ １ — ０ ３ ６ ８— ０ ３
嗜盐微 生物是一类生长在高盐环境 中的微生物 。我 国拥 有丰富的海洋资源 ， 其 中生长着大量 的嗜盐微 生物。 国内已 对新疆 、 西藏 、 内蒙古等地盐湖 中嗜盐微生物物种进行 了大量 研究 ， 表 明盐 湖 中生长 着大 量 的嗜盐 细菌 与 嗜盐古 菌 。
提试剂盒进行抽提 。
嗜盐细菌作为中度嗜盐菌 ， 分布广泛 ， 除存在于极端高盐环境 外， 还存 在 于海 洋 环 境 中 。 ， 耐受盐浓度 范围为 ３ ％ 一
１ ５ ％ Ｊ 主要是通过在 细胞
，
采 用上海生 工细菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ抽 反应体系：
内产生并积 累相 溶性溶质来平衡
殷 婷婷 ，薛梦 颖 ，丁 丽燕 ， 王 宇 ，齐 婕， 杨 丽 ，温 洪宇
（ 江苏师范大学生命科学学院 ， 江苏徐 州 ２ ２ １ １ １ ６ ） ．
摘要 ： 从连 云港盐 田卤水 中分 离到 １ 株 嗜盐 细菌菌株 ， 编号 为 ） （ Ｊ １ ２ ， 该菌株 细胞 形态为杆 状 ， 革 兰氏染色呈 阳性 ；
养基配制后在 １ ２ １ ． ５℃灭菌 ２ ０ ｍ ｉ ｎ 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ２ ． １ 菌落形态观察
将分离纯 化出的嗜盐 细菌菌株接种
于嗜盐 菌培养基平板 上 ， 置于 ３ ７℃恒 温培养 箱 中培养 ２ ４ ｈ 后进行菌落形态观察 ， 菌体形态通过扫描 电镜观察 。 １ ． ２ ． ２ 总Ｄ Ｎ Ａ的提取
水， 经分离纯化后 获得 １ 株嗜盐细菌 Ｘ Ｊ １ ２ ， 对其 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基
因序列进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 克隆后测 序 ， 得到 的序列 与相似性 序 列构建 分子发育树后进行 同源性 比较 和系统发育学 分析 ， 并 对其生长特性进行研究 ， 这对于完 善我 国高盐 环境 中嗜盐 细 菌的物种资源具有重要意 义 ， 有 助于对嗜盐 细菌的进一 步开
ｄ ｄ Ｈ２ Ｏ ２ ０ Ｌ 、 Ｐ Ｆ ２ ７正 向引物 （ ５ Ｉ ． ￣ ｍ ｏ ｌ Ｚ Ｌ ） ２ ｐ ， Ｌ 、 Ｐ Ｒ １ ４ ９ ２反向 引物（ ５ ｖ Ｌ ｍ ｏ ｌ Ｌ ） ２ ｔ ｘ Ｌ 、 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ １ Ｉ ｘ Ｌ 、 ２ Ｘ Ｔ ａ ｑ Ｍｉ ｘ ２ ５ Ｌ 。 所用引物为细菌通用 引物 ： 正 向引物 Ｆ ２ ７ ： ５ 一Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｉ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ － Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ一 ３ ； 反 向引物 Ｒ １ ４ ９ ２ ： ５ 一Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ １ － ｒ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ． Ｇ Ｔ Ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ一 ３ “ 。Ｐ Ｃ Ｒ条件 ： ９ ４℃ 预变性 ５ ｍ ｉ ｎ ； ９ ４℃ 变 性４ ５ ｓ ， ５ ５ ｏ Ｃ退 火 ４ ５ ｓ ， ７ ２ 延伸 １ ｍ ｉ ｎ ， ３ ０个 循环 ； 最后
外界 的高盐环境
研 究 。
。近年来 ， 国内已对 中度 嗜盐 菌 的生 理
１ ． ２ ． ３ １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增 ５ ０
特性、 遗传 多样 性和 耐盐 相关 基 因克 隆等方 面进 行 了相 关 前人对我 国高盐环境如盐 池、 盐 湖与盐 田的微 生物类 群 进行了大量 的研究 。连云港盐 田作 为我 国东 部沿海 的 主要产盐 区， 蕴藏着 丰富的 嗜盐微 生物资 源。针对 目前对 该 盐田嗜盐细菌物种研究较少 的现状 ， 通过采集 连云港盐 田 卤
采用细菌 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因通 用引 物对 ） （ Ｊ １ ２进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 扩增 出长约 １ ． ５ ｋ ｂ的 目的片段 ， 经过 克 隆后 测序 ， 得到
１ ５ ３ ０ ｂ ０的核苷酸 序列 ， Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 登 录号为 Ｊ Ｘ ９ ９ ２ ８ ４ ４ ； 利用 Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ａ ｌ ｘ １ ． ８软件 和 Ｍ Ｅ Ｇ Ａ ４ ． ０ 软 件对其 及相近 物种进行 同源性 比较和 系统发育学分析 ， 表明它属于嗜盐芽孢 杆菌 属 （ Ｈ ａ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ Ｕ ｕ ｓ ） ； 通过进 行不 同 ｐ Ｈ值 和 Ｎ ａ Ｃ １ 浓度对 ） （ Ｊ １ ２ 生长的影响试验研究 ， 结果表明， ｐ Ｈ值为７ ． ０ — ８ ． ０ 、 Ｎ ａ Ｃ １ 浓度为 ２ ． ０ ｍ ｏ Ｌ ／ Ｌ 时， ） 【 Ｊ １ ２生长情况最佳； 通过绘制 步生 长 曲线 ， 表明 ） 【 Ｊ ｌ ２ 在３ ７℃培养条件下 ， ０— ６ ｈ 是 延滞期 ， ６ ～ １ ２ ｈ为对数 生长期 ， １ ２ ｈ 后进入稳定期。 关键词 ： 嗜盐细菌 ； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因 ； Ｐ Ｃ Ｒ； 克隆 ； 系统发 育
江苏农业科学
２ ０ １ ３ 年第 ４ １ 卷第 １ １ 期
殷婷婷， 薛梦颖， 丁丽燕， 等．嗜盐细菌 ｘ Ｊ １ ２的分 子鉴定 与生长特性研 究［ Ｊ ］ ．江苏农业科学 ， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ １ １ ） ： ３ ６ ８— ３ ７ ０
嗜盐 细菌 Ｘ Ｊ １ ２的分子鉴定与生长特性研究
１ ． １ 材 料
７ ２ 延伸 １ ０ ａｉ ｒ ｎ 。Ｐ Ｃ Ｒ产物 ４℃保存 。 １ ． ２ ． ４ Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物胶回收 存备用 。 １ ． ２ ． ５ 与ｐ Ｍ Ｄ１ ８一 Ｔ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 连接和转 化 按 照宝生物 工程
（ 大 连） 有限公司 Ｐ Ｃ Ｒ产 物克 隆用载体 ｐ ＭＤ １ ８一Ｔ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 试
中图分 类号 ： Ｘ １ ７ ２ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） １ １ — ０ ３ ６ ８— ０ ３
嗜盐微 生物是一类生长在高盐环境 中的微生物 。我 国拥 有丰富的海洋资源 ， 其 中生长着大量 的嗜盐微 生物。 国内已 对新疆 、 西藏 、 内蒙古等地盐湖 中嗜盐微生物物种进行 了大量 研究 ， 表 明盐 湖 中生长 着大 量 的嗜盐 细菌 与 嗜盐古 菌 。
提试剂盒进行抽提 。
嗜盐细菌作为中度嗜盐菌 ， 分布广泛 ， 除存在于极端高盐环境 外， 还存 在 于海 洋 环 境 中 。 ， 耐受盐浓度 范围为 ３ ％ 一
１ ５ ％ Ｊ 主要是通过在 细胞
，
采 用上海生 工细菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ抽 反应体系：
内产生并积 累相 溶性溶质来平衡
殷 婷婷 ，薛梦 颖 ，丁 丽燕 ， 王 宇 ，齐 婕， 杨 丽 ，温 洪宇
（ 江苏师范大学生命科学学院 ， 江苏徐 州 ２ ２ １ １ １ ６ ） ．
摘要 ： 从连 云港盐 田卤水 中分 离到 １ 株 嗜盐 细菌菌株 ， 编号 为 ） （ Ｊ １ ２ ， 该菌株 细胞 形态为杆 状 ， 革 兰氏染色呈 阳性 ；
养基配制后在 １ ２ １ ． ５℃灭菌 ２ ０ ｍ ｉ ｎ 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ２ ． １ 菌落形态观察
将分离纯 化出的嗜盐 细菌菌株接种
于嗜盐 菌培养基平板 上 ， 置于 ３ ７℃恒 温培养 箱 中培养 ２ ４ ｈ 后进行菌落形态观察 ， 菌体形态通过扫描 电镜观察 。 １ ． ２ ． ２ 总Ｄ Ｎ Ａ的提取
水， 经分离纯化后 获得 １ 株嗜盐细菌 Ｘ Ｊ １ ２ ， 对其 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基
因序列进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 克隆后测 序 ， 得到 的序列 与相似性 序 列构建 分子发育树后进行 同源性 比较 和系统发育学 分析 ， 并 对其生长特性进行研究 ， 这对于完 善我 国高盐 环境 中嗜盐 细 菌的物种资源具有重要意 义 ， 有 助于对嗜盐 细菌的进一 步开
ｄ ｄ Ｈ２ Ｏ ２ ０ Ｌ 、 Ｐ Ｆ ２ ７正 向引物 （ ５ Ｉ ． ￣ ｍ ｏ ｌ Ｚ Ｌ ） ２ ｐ ， Ｌ 、 Ｐ Ｒ １ ４ ９ ２反向 引物（ ５ ｖ Ｌ ｍ ｏ ｌ Ｌ ） ２ ｔ ｘ Ｌ 、 基 因组 Ｄ Ｎ Ａ １ Ｉ ｘ Ｌ 、 ２ Ｘ Ｔ ａ ｑ Ｍｉ ｘ ２ ５ Ｌ 。 所用引物为细菌通用 引物 ： 正 向引物 Ｆ ２ ７ ： ５ 一Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｉ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ － Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ一 ３ ； 反 向引物 Ｒ １ ４ ９ ２ ： ５ 一Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ １ － ｒ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ． Ｇ Ｔ Ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ一 ３ “ 。Ｐ Ｃ Ｒ条件 ： ９ ４℃ 预变性 ５ ｍ ｉ ｎ ； ９ ４℃ 变 性４ ５ ｓ ， ５ ５ ｏ Ｃ退 火 ４ ５ ｓ ， ７ ２ 延伸 １ ｍ ｉ ｎ ， ３ ０个 循环 ； 最后
外界 的高盐环境
研 究 。
。近年来 ， 国内已对 中度 嗜盐 菌 的生 理
１ ． ２ ． ３ １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增 ５ ０
特性、 遗传 多样 性和 耐盐 相关 基 因克 隆等方 面进 行 了相 关 前人对我 国高盐环境如盐 池、 盐 湖与盐 田的微 生物类 群 进行了大量 的研究 。连云港盐 田作 为我 国东 部沿海 的 主要产盐 区， 蕴藏着 丰富的 嗜盐微 生物资 源。针对 目前对 该 盐田嗜盐细菌物种研究较少 的现状 ， 通过采集 连云港盐 田 卤
采用细菌 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因通 用引 物对 ） （ Ｊ １ ２进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 扩增 出长约 １ ． ５ ｋ ｂ的 目的片段 ， 经过 克 隆后 测序 ， 得到
１ ５ ３ ０ ｂ ０的核苷酸 序列 ， Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 登 录号为 Ｊ Ｘ ９ ９ ２ ８ ４ ４ ； 利用 Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ａ ｌ ｘ １ ． ８软件 和 Ｍ Ｅ Ｇ Ａ ４ ． ０ 软 件对其 及相近 物种进行 同源性 比较和 系统发育学分析 ， 表明它属于嗜盐芽孢 杆菌 属 （ Ｈ ａ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ Ｕ ｕ ｓ ） ； 通过进 行不 同 ｐ Ｈ值 和 Ｎ ａ Ｃ １ 浓度对 ） （ Ｊ １ ２ 生长的影响试验研究 ， 结果表明， ｐ Ｈ值为７ ． ０ — ８ ． ０ 、 Ｎ ａ Ｃ １ 浓度为 ２ ． ０ ｍ ｏ Ｌ ／ Ｌ 时， ） 【 Ｊ １ ２生长情况最佳； 通过绘制 步生 长 曲线 ， 表明 ） 【 Ｊ ｌ ２ 在３ ７℃培养条件下 ， ０— ６ ｈ 是 延滞期 ， ６ ～ １ ２ ｈ为对数 生长期 ， １ ２ ｈ 后进入稳定期。 关键词 ： 嗜盐细菌 ； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基 因 ； Ｐ Ｃ Ｒ； 克隆 ； 系统发 育
江苏农业科学
２ ０ １ ３ 年第 ４ １ 卷第 １ １ 期
殷婷婷， 薛梦颖， 丁丽燕， 等．嗜盐细菌 ｘ Ｊ １ ２的分 子鉴定 与生长特性研 究［ Ｊ ］ ．江苏农业科学 ， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ １ １ ） ： ３ ６ ８— ３ ７ ０
嗜盐 细菌 Ｘ Ｊ １ ２的分子鉴定与生长特性研究