分子生物学(中文)5 分子生物学基本研究法
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由人工构建的具有两种不同复制起点和选 择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的质粒载体。
这类质粒载体可保证外源DNA序列在不 同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途 广泛。
7、pBluescript噬菌粒载体
pBluescript是一类从pUC载体派生 而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-）， 如今则更多地叫作pBluescript KS（+/）或pBluescript SK（+/-）。
(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因， 作为转化子克隆的选择标记；
(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-galIPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的 重组子。
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA 连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足 基因工程的要求，只有将它们连接到具备自 主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞 中进行繁殖。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs.
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体
LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽， IPTG（异丙基- β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表 达，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺 陷型β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶， 水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。
5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按 分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成 为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互 作用的重要实验手段。
5、 pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗 性基因和一个lacZ'基因。
含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA 聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7 或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转 录出相应的mRNA。
6 、 穿 梭 质 粒 载 体 （ shuttle plasmid vector）
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同 样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之 间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。
• 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主 细 胞 中 ColE1 质 粒 的 拷 贝 数 达 到 1000~3000 个 ， 占细胞总DNA的50%左右。
3、pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因（AmpR）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因（tetr）；
单核苷酸5‘-磷酸基团向核酸链的3’-OH发起进攻
（二）基因克隆的载体 载体三要素：
• 自我复制能力 • 携带外源基因片段大小 • 插入位点多少 易于鉴定识别程度
大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及 EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、 PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等 3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在 DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱 基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平 均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46）， 而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就 有一个酶切位点（44）。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶
类
功
能
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的 DNA复制起点（ori）。
•优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯 化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作 仍较便利。
•有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。
•有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每Leabharlann Baidu细胞 可 累 积 1000~3000 个 拷 贝 ， 便 于 制 备 重 组 体 DNA。
表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片 段的能力
凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp）
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚丙烯酰胺
500~25
20.0%聚丙烯酰胺
ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系
前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经 RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始 DNA合成。
RNA 1在RNA 2的5’末端，转录方向相反，因此能 通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工 RNA 2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起 始。
(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和 T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位 点上的外源基因的转录活动；
(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自 ColE1 质 粒 的 复 制 起 点 ， 保 证 pBluescript 噬 菌 粒 载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按 照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；
没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。
pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的 lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作 用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化 子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同 粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片 段直接克隆到pUC8质粒载体上。
限制性核酸内切酶
识别并在特定位点切开DNA
DNA连接酶
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接 成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双 链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补 原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端 （进行末端标记实验或用来进行DNA的连接
大肠杆菌 pSC101 质 粒载体示 意图。
是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧 型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞 仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中 提取pSC101 DNA，产量很低。
2、ColE1质粒载体
• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细 胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主 染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之 停止。
上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源 自工具酶的发现。
5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶
能 够 识 别 DNA 上 的 特 定 碱 基 序 列 并 从 这 个 位 点 切 开 DNA分子。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发 现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分 子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进 入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定 的繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强 调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因 置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术 区别于其它生命科学技术的根本特征。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子 克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体 和质粒等小分子量复制子都可以作为基 因导入的载体。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成 的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为 细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中， 才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。
三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐 明了遗传信息的流动与表达机制。
Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即 中心法则）。
中心法则的演变
1954年首次 提出的“中心法则”
1970-1980年 的“中心法则”
21世纪后修正 的“中心法则”
4、pUC质粒载体（包括四个部分）： • 来自pBR322质粒的复制起点（ori） • 氨苄青霉素抗性基因（ampr） • 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）启动子及编
码α-肽链的DNA序列。特称为lacZ’基因 • 位 于 lacZ’ 基 因 5’- 端 的 一 段 多 克 隆 位 点
（MCS），外源基因插入破坏lacZ ’基因功能
分子生物学（中文）5 分子生物学基 本研究法
扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放
下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁 点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受 影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可 能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能 走在别人的前面。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞 转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定 点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技 术。
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速 度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电 场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它 与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数 成正比，与片段大小成反比。
生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态， 所 以 ， DNA 和 RNA 又 被 称 为 多 聚 阴 离 子 （polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。
末端转移酶
在双链核酸的3‘末端加上多聚或单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链末端的磷酸基团
嘌呤
腺嘌呤
鸟嘌呤
嘧啶
胞嘧啶
尿嘧啶
胸腺嘧啶
组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式
多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程
• SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照 SacI→KpnI的方向转录；
• （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的 取向。
• f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助 噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的 有 意 义 链 DNA ； 而 f1 （ - ） 起 点 则 表 示 当 pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细 胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。
重组DNA技术发展史上的三大里程碑：
一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决 了遗传的物质基础问题。
二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型 和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世 代交替问题。
Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue.
含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA 分子的菌落为白色。
优点：
更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础 上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素 抗 性 基 因 及 复 制 起 点 ， 其 分 子 小 了 许 多 ， pUC8 为 2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因， pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达 500~700个拷贝。
这类质粒载体可保证外源DNA序列在不 同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途 广泛。
7、pBluescript噬菌粒载体
pBluescript是一类从pUC载体派生 而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-）， 如今则更多地叫作pBluescript KS（+/）或pBluescript SK（+/-）。
(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因， 作为转化子克隆的选择标记；
(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-galIPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的 重组子。
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA 连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足 基因工程的要求，只有将它们连接到具备自 主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞 中进行繁殖。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs.
图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体
LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽， IPTG（异丙基- β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表 达，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺 陷型β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶， 水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。
5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按 分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成 为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互 作用的重要实验手段。
5、 pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗 性基因和一个lacZ'基因。
含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA 聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7 或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转 录出相应的mRNA。
6 、 穿 梭 质 粒 载 体 （ shuttle plasmid vector）
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同 样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之 间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。
• 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主 细 胞 中 ColE1 质 粒 的 拷 贝 数 达 到 1000~3000 个 ， 占细胞总DNA的50%左右。
3、pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因（AmpR）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因（tetr）；
单核苷酸5‘-磷酸基团向核酸链的3’-OH发起进攻
（二）基因克隆的载体 载体三要素：
• 自我复制能力 • 携带外源基因片段大小 • 插入位点多少 易于鉴定识别程度
大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及 EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、 PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等 3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在 DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱 基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平 均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46）， 而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就 有一个酶切位点（44）。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶
类
功
能
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的 DNA复制起点（ori）。
•优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯 化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作 仍较便利。
•有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。
•有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每Leabharlann Baidu细胞 可 累 积 1000~3000 个 拷 贝 ， 便 于 制 备 重 组 体 DNA。
表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片 段的能力
凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp）
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚丙烯酰胺
500~25
20.0%聚丙烯酰胺
ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系
前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经 RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始 DNA合成。
RNA 1在RNA 2的5’末端，转录方向相反，因此能 通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工 RNA 2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起 始。
(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和 T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位 点上的外源基因的转录活动；
(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自 ColE1 质 粒 的 复 制 起 点 ， 保 证 pBluescript 噬 菌 粒 载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按 照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；
没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。
pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的 lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作 用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化 子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同 粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片 段直接克隆到pUC8质粒载体上。
限制性核酸内切酶
识别并在特定位点切开DNA
DNA连接酶
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接 成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双 链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补 原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端 （进行末端标记实验或用来进行DNA的连接
大肠杆菌 pSC101 质 粒载体示 意图。
是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧 型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞 仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中 提取pSC101 DNA，产量很低。
2、ColE1质粒载体
• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细 胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主 染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之 停止。
上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源 自工具酶的发现。
5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶
能 够 识 别 DNA 上 的 特 定 碱 基 序 列 并 从 这 个 位 点 切 开 DNA分子。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发 现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分 子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进 入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定 的繁殖和表达。
基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强 调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达。
事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因 置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术 区别于其它生命科学技术的根本特征。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子 克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体 和质粒等小分子量复制子都可以作为基 因导入的载体。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成 的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为 细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中， 才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。
三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐 明了遗传信息的流动与表达机制。
Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即 中心法则）。
中心法则的演变
1954年首次 提出的“中心法则”
1970-1980年 的“中心法则”
21世纪后修正 的“中心法则”
4、pUC质粒载体（包括四个部分）： • 来自pBR322质粒的复制起点（ori） • 氨苄青霉素抗性基因（ampr） • 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）启动子及编
码α-肽链的DNA序列。特称为lacZ’基因 • 位 于 lacZ’ 基 因 5’- 端 的 一 段 多 克 隆 位 点
（MCS），外源基因插入破坏lacZ ’基因功能
分子生物学（中文）5 分子生物学基 本研究法
扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放
下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁 点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受 影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可 能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能 走在别人的前面。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞 转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定 点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技 术。
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速 度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电 场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它 与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数 成正比，与片段大小成反比。
生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态， 所 以 ， DNA 和 RNA 又 被 称 为 多 聚 阴 离 子 （polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。
末端转移酶
在双链核酸的3‘末端加上多聚或单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链末端的磷酸基团
嘌呤
腺嘌呤
鸟嘌呤
嘧啶
胞嘧啶
尿嘧啶
胸腺嘧啶
组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式
多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程
• SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照 SacI→KpnI的方向转录；
• （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的 取向。
• f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助 噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的 有 意 义 链 DNA ； 而 f1 （ - ） 起 点 则 表 示 当 pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细 胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。
重组DNA技术发展史上的三大里程碑：
一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决 了遗传的物质基础问题。
二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型 和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世 代交替问题。
Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue.
含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA 分子的菌落为白色。
优点：
更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础 上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素 抗 性 基 因 及 复 制 起 点 ， 其 分 子 小 了 许 多 ， pUC8 为 2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因， pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达 500~700个拷贝。