表皮生长因子ELISA检测方法的建立

３９．６９ ４４．１０ ５２．９５ ６１．８８ ７３．３６ ８０．１９ ９１．６９ ９８．９２ ｌｏｏ．ＯＯ
Ｏ．５ ０．２５ Ｏ
表３－３：ＥｌＦ的ｃｉＥＬＩｓＡ检测结果
以表３－３的（％Ｂ／Ｂ０）对Ｌｇ（ＥＧＦ）进行回归分析，得到一条回归直线（回 归方程为ｙ＝．０．１２８１Ｌｎ（ｘ）＋Ｏ．８１１６，相关系数Ｒ２＝０．９９３８，其中Ｙ为（％Ｂ／Ｂ０），ｘ 为Ｌｇ（ＥＯＦ）。从图３・２可知：在Ｏ．５ｎｇ／ｍｌ－３２ｎｇ／ｍｌ之间，曲线呈良好的线性关系， 且曲线的斜率较大，故检测范围为０．５ｎｇ／ｍｌ－３２ｎｇ／ｍｌ。
再美丽羁ｌ／ＬＨ２ｓＯｔ （注： 鼠ＩｓＡ溶液静酝翻觅筵二帮分）
２．２方法
２．２ ．１抗ｒｈＥＧＦ多克隆抗体的制备
１）戳 ｒｈ黼Ｆ鞭白为抗原，取成年雄性新西兰大白兔４只，在辩其进行撼础 免疫前 采墩斑清备用，睫聪进行免疫。
２）２ ．５ｍ１无菌双蒸水溶解１ｍｇＥＧＦ，然后与２．５ｍｌ的完众佛氏後剂充分混合
０
１４９
０．１３５ ０．２１２ ０．４０２ Ｏ．６１８ １．０６０ １．１４５ １．３００
Ｏ．１２ｌ ０．２０２ ０．３９２ ０．６００ １．０２ｌ １．１４０ １．３０１
０．０９５ ０．２０８ ０．４０１ ０．５８９ １．０２２ １．１ ３２ １．２２７
０．０８７ ０．１９１ ０．３８５ ０．５８１ １．０１０ １．１２５ １．２５６
千
Ｉ．２４９ ｌ ０１０ １／８１９２
千
０ ６６７ ０．６０６ ｌ／１６００
４ｉ
０．３１０ ０＿３１０ １，３２０ ０．０３９ ０．０３６
０
年
ｌ １ ２ ２９６ ２．３４４
千
ｌ ０３２ １．０８６
千
０．６０９ ０．６１９
工
０．３８０ ０ ４０４
工
０．２８５ ０ ２９５
工
０１１９ ０１１４
ｉ
０ ０７８ ０．０６９
各浓度板间变 异系数
总的板间变异 系数
４０．８９
１．０４
２．５
４４．２３ ４７．２５ ５４．３８
４５．５３
ｌ＿５５
３．４
５０．３１
４８．２２ ６５．２４ ４
５０
９７
３．１３
６ ｌ
５７．６８
５９．８３
６０
９２
３．９０
６．４
４．３６
６７ ２２
７３．６ｌ ７２．５７ ４．９２
６．８
７６．８９
７８．９６ ８２
从图３－１可知：在３７０Ｃ反应更快
达到平衡。为了节约时间，采用３７０ＣＩ小时为最佳阻断反应温度和时间。
表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用
图３－１：温度和时间对阻断反应的影响
一●一 ２５０Ｃ—－一 ３７０Ｃ
３．３．１．４ ３．３．１．４．１
ｃｉＥＬＩＳＡ标准曲线的建立 ＥＧＦ的ｃｉＥＬＩＳＡ检测：所得结果见表３．３、图３．２。
５０
ｕ
ｌ／孔。
表皮生长因子酶联免疫Ｉ簸附试验检测方法的建立及初步临床成用
８）测Ｏｎ。。：置ＭＫ２酶标仪测定４５０ｎｍ波长的ＯＤ值。 ３，２。２。《绫整范鋈 以ｒｈＥＧＦ浓度对４５０ｎｍ吸光魔德绘图，绘制标准曲线。通过标准曲线求质控 及待测样品的浓度。 ３。２．２．５矮控品检测戆精密度器缕确发评徐 准备３个标准储存液及１个４０００ｐｇ／ｍｌ的质控样品。每天针对１个标准储存 液（稀释后获７个标准值）作标准曲线，每次作两个标准曲线。作每一标准曲线 均俸３令滚廑豹矮羧襻晶，每一浓麟祥鑫缘痒复魏。连续３天霹褥６条标准瓣线。 精密魔以％ＲＳＤ（相对标准偏差）表求，准确度以％ＲＥ（相对误麓）表示。精密度 和准确魔以质控样晶捻测结果计算。 ３，２．２．５蕨控撵鑫戆稳定毪译俊 观察质控检测值在质控标定慎士２ＳＤ时的最大冻融次数。
万
０ ０６９ ０ ０６２
０万
０．０５６
０
０．１５８ ０１６５
０ ０４８ ０ ０５１
０６０
表３－１；多抗和包被抗原最佳浓度的筛选
ＢＧＦ．ＰｃＡｂ ＥＧＦ ｎｇ，／ｒｎｌ １／５ Ｉ／６ ｌ广７ １／８
１／９
１／１０
１／１１
１／１２
１／１３
１／１４
空 白
万
万
万
万
万
万
万
万
万
万
１００００ ｌｏｏＯ １００ １０ ｌ Ｏ．１ ０
从表３－３可知当［ＥＧＦ］达到０．５ ｎｇ／ｍｌ时，ＯＤ４５０ｎｍ值与０ ｎｇ／ｍｌ时的 ＯＤ４５０ｎｍ值出现明显差异，故检查限为０．５ ｎｇ／ｍｌ。
【ＥＧＦ】ｒｉｇ／ｍ！
ＯＤ４５０响
％Ｂ／Ｂｏ
３２ １６ ８ ４ ２
１
０．５１６ ０．５４８ ０．６３９ ０．７６４ ０．９１３ １．０６０ １．１６２ １．２８９ １．３００
６７
８２ ４９
３．４５
４．２
８５．８４
９４．０７
０．５
８８．１８ ９１．１６
９８．７６
９ｌ
１４
２．９５
３．２
Ｏ
１００．０４
１０３ ２ｌ
１００．６７
２．２９
２．３
表３－４：ｃｉＥＬＩｓＡ标准曲线批间误差
４２
表皮生长困子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用
蛭５ｕｇ／ｍｌ趸；ＥＧＦ珀０。２５～８ｎｇ／ｍｌ与疗夔：Ａ４５０ｎｍ勤０。｛ｉ～ｌ？５１￥象ｊ稽短樽 蕈镟， １．３，２÷２强硎獭皤 稻渊一连垮谢碴蓄臻ＥＬＩＳＡ里程ｉ ＥＧＦ憾ｍ痿萌嚼薹“冀蘩篱嚣ｊ誊醚蒸荆 ，则ＥＧＦ和ＥＧＦＲ阳性率越高。ＢｏｒｒｍａｎｎＩＩＩ、Ⅳ型（浸润型）的ＥＧＦ、 鲤划型溜塞壅焉憾忱磊躞墨；鞲箬晕错矧Ｒ２—０÷９９７１；｛；；｝盆堡受酣０ｊ｜ｉ女～
杂匿虢嚣ｊ委ｆ搿潲毽强灞灞摅原抗体结合率睫麓下降。
Ｆｉ ｇ．２—２：ｓｔａｎｄａｒｄ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅ瞻ｅｎｔ ｏｆ ｒｈＥＧＦ
一・ 一
赡Ｅ弹浓发
２．３．２对ｒｈＥＧＦ抗血清纯度和特异性的检测 抗ｒｈ 测检的性异特和度纯清血抗Ｆ
抗ｒｈＥＧＦ多
表皮生长瓣予酶载免疰暖辩试验硷测方法酶建立及裙步牾寐应麓
０．２４５ ０，３９２ ０．６１４ ０．９９８ １．２０ｌ １．４２１ １．５４９
Ｏ．２１４ ０．３５８ ０．５５７ ０．８２５ １．１９４ １．３６０ １．４３５
０．１８７ ０－３１４ ０．５２６ ０．７８３ １．２０ｌ １．３０７ １．３９５
Ｏ．１６８ ０．２９３ ０．４９８ ０．７４５ １．１５５ １．２２４ １．３５２
ｉ００ Ｈ
ｉ／孔，４＂Ｃ，澄盒内包被过夜。
２）封闭；用０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）洗涤３次，拍干后加ｉ５％小牛血清 的ＰＢＳ封闭，３００ｕｌ／孔，３７℃，ｌｈ，然后用ＰＢＳＴ洗涤３次。 ３）按上述浓度秘入ｉ００＃ｌ／孑Ｌ标准晶，矮羧鼹及待捡测群品，麓佟复琵。酶标 羧巍霆温瓣弯２ｈｒ露矮０。０５％Ｔｗｅｅｎ－２０豹ＰＢＳ（Ｐ酷｛）洗涤３次弗撼予。 ４）以棋盘滴定选定的多抗浓度在每个酶标张中加入ｉ００ｐ １多抗，酶标板在室温 孵宵ｌｈｒ后用０．０５％Ｔｗｅｅｎ一２０的ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）洗涤３次并拍干。 ５）加酶标二抗：ＰＢＳＴ洗涤３次后加ｌ：８０００稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔ＩｇＧ，１００驻Ｉ／魏，璧澈孵毒强。 ６）ＰＢＳＴ洗涤４次后，加酝剖的底物液ＴＭＢ和Ｈ２０２各的ｕｌ／孔，３７℃１５ｍｉｎ。 ７）终止反应：加入２ＭＨ。Ｓ０４，
将大囱 咔寰彩占
锓掷
将大囱兔
表皮生长圈子酶联免疫暇附试验检测方法的建立及韧步临珠应用
３）阻断反应：采用根外阻断模式：将一定浓度３２，１６，８。４，２，１，０．５，
０，２５ｎｇ／ｍｌｒｈＥＧＦ ５０＃ｉ／魏，１：１０万耩释度弱ｒｈＥＧＦ撬盘瀵５０＃１／魏攘灭酶橼叛，
加入没宵包被ｒｈＥＧＦ但已用封闭液封闭的Ｗ靛板ｉ０攀圜滩清罐！：３７ ４Ｃ；抗皿§≤；
０．０６５ Ｏ．１８６ ０．３５２ ０．５７３ ０．９９３ １．１２３ １．２２４
０．０４７ ０．０４５ ．０４６０ ．０４６０ ０．０４３ Ｏ．０４６ ０．０４６
０．２２２ ０．４６２ ０．６９１ １．０９７ １．１９６ １．３０８
表３－２：抗ＥＧＦ多抗饱和浓度的精确筛选
３．３．１．３阻断时间和温度对测定结果的影响
表皮生长园子酶联免疫吸附试验检测方法的建立罄墨掣乏絮鉴糕
霪羹鋈囊
霾霾塑鬟黧鏊ＥＬＩＳＡ羹鋈羹羹鬻囊嚣
爨囊测慰西觏；巍掣髫ＥＬＩＳＡ！｝直ｌ矧鎏赢二墨笺ＥＧＦ嚣职囊《撼静＆黪嗡兹； 嚣裾弱嚣越臻舾期ｒｈＥＧＦ磐妻蠹蓠习裂蕊若巍矮密，裂巍戮莪豢嚣羔懿ＥＬＩＳＡ（曩 浸嚣珏ＥＬＩＳＡ；一嗝一籀镉镭瓣ＥＬＩＳＡ）爱独ＥＧＦ，霖墨蔫帑糕蕊滔堵磊璀堪溻遑
（１）批内误差：每～标准样品浓度作４次熏复，以其批内变异系数表示批内 误麓。 （２）批间误差：重复步骤７操作，连续３次，以其批闻变异系数表示批间误
差。
３．２．２单抗一多抗夹心ＥＬＩＳＡ基本程序 ３．２．２．１标准品和质控样鼎的制备 冻干的重组ｈＥＧＦ购囱深圳华生元基因工糨有限公司，用抗原稀释液溶解并 醚铡成浓度为０．８ｍｇ／ｍｌ的标准赡存液，小鬃分装存于一８０＂Ｃ备用。标准晶在检溅 蠹蓼瓣撬藤耩释滚凝鲜鬣麓，储存蠢准晶最终怒镬浓度旁１２５，２５０，５００，１０００， ２０００，４０００和８０００ｐｇ／ｍｌ。质控品由标准储存液通过抗原稀释液稀释为 ４０００ｐｇ／ｍｌ，检测时用抗原稀释液稀释为２５０，１０００和４０００ｐｇ／ｍｌ的浓度。质控 品和标准品均存于一８０℃。 ３．２。２，２包疆撬体及揍纛瀵王终浓度鳃选撵 采羽摸盘滴定法，识被荦抗采用ｌＯｕｇ／ｍｌ，５ｕｇ／ｍｌ，２。ｓｕｇ／ｍｌ ３个浓度；多 抗漾用４０，２０，ｉ０，５ｕｇ／ｍｌ ４个浓度；ｒｈＥＧＦ采用０，２５～８ｎｇ／ｍｌ系列倍比稀释。 酶标＝抗的工作浓度为１：８０００。 ３．２．２。３夹心法的ＥＬＩＳＡ蒎本操作过程 １）酝被：戳０。０５Ｍ，ｐＨ９．５辩‰ｅ逸一ＮａＨＣＯ。缓狰滚壤５＃ｇ／ｍｌ魏ｒｈＥＧＦ包较酶耩投，
表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步Ｉ临床应用
１２０．００％ １００ ＯＯ％
（％一料器嚣
８０．００％ ６０．００％ ４０．００％ ２０ ００％
０．００％ ０
１
ｌ
ｉ０
１００
Ｌｇ［ＥＧＦ］
图３－２：ｃｉＥＬＩＳＡ检测的wenku.baidu.com准曲线
陋Ｍｌ板间黧结Ａ 板鬣嚣率ＳＤ
４１．２７ ３２ ３９．７２ ４１．６９ ４５ １０
ＥＧＦＲ和 二者同步表达阳性率均比Ｉ、ＩＩ型（局限型）明显增高。ｓｕｇｉｙａｍａ等。” ８ｎｇ／度越低 亦报告同 样的结论。ｏｎｄａ等。”报道硬癌中的ＥＧＦ和ＥＧＦＲ与ＥＧＦＲ共同表达的阳
性率明显 高于髓样癌，说明ＥＧＦ及其受体是刺激胃癌纤维化的因素，其机制可能 与胃癌的 自分泌和旁分泌有关，胃癌细胞产生的ＥＧＦ不仅作用与癌细胞本身，而 且作用于 癌细胞周围的成纤维细胞使其合成胶原，产生大量纤维组织，形成预后 较差的硬 癌”１。Ｙｏｎｅ叫ｒａ等…１报道侵犯粘膜下层，肌层和浆膜下及浆膜胃癌的
从袭３—２看到：多抗的精确稀释度为ｌ：１０万，此浓度所得的灵敏度嵩，同
表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用
时也满足了零抑制的ＯＤ４９０ｎｍ值达到１．３，接近１．０同时接近粗筛稀释度以及易
于稀释。
ＥＧＦ．ＰｃＡｂ ＥＧＦ ｕｇ／ｍ１ ｌ
ｌ
ｌ，２０００
１／４０００
１／８０００
ｌ／１６
３．２．３线性评价
鼹楚浓度襻本黪蕊魄嚣释惹魄较溅定篷与预期篷。 ３．２．４检测方法的稳定性实验 取商、中、低浓度ＥＧＦ的三份脏清标本，予同一批内各测定１０次，计算批 蠹变劈系鼗；在不阉梭溅窭冬溅定６次，诗篓拯耀变募系数。 ３，２．５阐收实验 于融知ＥＧＦ浓度的正常混合胤清标本内各加入系列浓度的ＥＧＦ（５０、２５、 １２．５ｎｇ／ｍｔ），遘霉亍必，§ＥＬＩＳＡ测是，计算回收率。
１／３２
１／６４
１／１２８
１／２５６
ｌ／５１２
１／１０２
０
工
３．３２３ ３ ０１ｌ １／６４ ３．０９２ ２．９０７ １／１２８ ３．１３０ ２．９３Ｉ １／２５６ ３１００ ２ ９５７ ｌ／５１２
千
３ １７３ ２．６１６ １／１０２４
；
２．５７６ ２ ３６２ １／２０４８
ｊ二
千
ｌ ９２５ １．９７３ １／４０９６
３．３结果及分析 ３．３．１阅续竞争ＥＬＩＳＡ梭测方法的戆果及分爨 ３．３．１．１多抗和包被抗原最佳浓壤的筛选： 方阵滴定结果见袭３一ｌ
从液３一ｌ及２可见。当ＯＤ４９０。值接近１．０时，抗ＥＧＦ多挽的稀释度为１： １２８０００。故实验采用ｌ，ＯＯ韭ｇ／ｍｌ为馁被抗原的工终浓度，ｌ：１２８０００为多抗瓣工 作浓度。毡被抗原浓度参考文献。 ３．３．１．２抗ＥＧＦ多ｊ宄饱和浓度的精确值： 方阵滴定结果见袭３，２
成掣Ｉ状物
３）第 一次免痰：１ｍ１／熙兔子，每个前肢注射０．５ｍｌ
兔爨碘 溪潺毒被注瓣簿霞｛ｌ蓼菠，曩ｌ娃瀵毒懿注射嚣旋下注冀重，壹裂鼓起 一乳白 色小包。继续喂养，一个月厝第二次免疫。 ４）第 二次免疫：ｌ燕ｌ／袋兔子，每个爱簸注瓣０。ｓ瑶ｌ，方法露第一次免疫， ～个星 期詹试血。
２．２ 。２藏斑清静收集帮分离