利用mtDNA+COⅠ基因序列鉴定我国烟粉虱的生物型
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罗 晨等：利用ｍｔＤＮＡ ｃＯｌ基因序列鉴定我国烟＃）虱的生物型
７６ｌ
截取７２０ ｂｐ的序列进行分析（图１）。可以看出，５ 条７２０ ｈ【Ｉ的序列在所有的位点上都是埠Ｅ的。各个 碱基的含量为：１８２
作比较，从而为鉴定在我国暴发危害的烟粉虱生物
型和确定其来源提供分子生物学的证据。
１．４琼脂糖凝胶电泳 ＰＣＲ产物以１ ６％琼脂糖凝胶电泳分离，ＥＢ染 色后在紫外透视仪Ｅ观察，记录结果。
１．５
ｌ材料与方法
Ｉ．１材料
ＰｃＲ产物回收纯化 在电泳巾检测到目标片段后，进行产物纯化。
５个地理区域或寄主植物上的烟粉虱种群，经 室内镜检ｌｏ头以ｒ ４龄若虫（伪蛹）的形态特征， 确定为烟粉虱后．再进一步做分子乍物学试验。其 编号、寄士、采集地、采集时间见表ｌ。
的离心管底部将粉虱充分研磨匀浆，将匀浆液吸入 ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。向管中加入１止２０哗，
万方数据
本实验方法重复性好，水浴２ ｈ提取的烟粉虱单个
个体的ＤＮＡ足以进行ＰｃＲ反应，其产物大小在 ８３ｌｌⅢ和９４１ｂｐ之间，与预计中的产物大小相近。
可以初步判定该产物是所需的日的片段。 ２．２测序结果分析
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列进行比较。
２３
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１．２
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２００２，４５（６）：７５９—７６３
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０４５４—６２９６
利用ｍｔＤＮＡ Ｃｏ Ｉ基因序列鉴定我国烟粉虱的生物型
晨ｌ，姚
远２，王戎疆２，阎凤鸣”，胡敦孝３，张芝利
ｌＯ呻８９：２北京大学生命科学学院，北京
１００８７ｌ； ３
北京市农林科卞院植保环保所．北京
其镜检特征和危害西葫芦造成的银叶症状与国外报 道的Ｂ型烟粉虱相似，怀疑我国最近发生的烟粉
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２结果与分析
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为保证实验的可重复性，在提取ＤＮＡ时，对 北京西红柿种群的个体进行了水浴不同时间的效果 试验，并对ＰＣＲ产物进行电泳检测。结果证明．
ａｎｄ
有非常重要的意义。
目前在全世界危害最严重的是Ｂ型烟粉虱。 ＢｅＩｌｏｗｓ等（１９９４）在形态Ｐ对Ｂ型烟粉虱和Ａ型 烟粉虱进行了描述：Ｂ型烟粉虱蛹壳上多数无第Ｐｑ 根亚前缘毛，其尾气管孔Ｌ３的蜡缘饰宽度一般不超 出尾刚毛；而Ａ型烟粉虱则相反。尽管Ｂ型很难 通过形态确认，但它在生物学特征ｒ和原来泛指的 烟粉虱（Ａ型）存在着明显的差异（Ｐｅ而ｎｇ
ｅ￡卅，
Ｈａｌｓｅｖ，１９７８）。近年来，烟粉虱大范围扩散，
已成为一种世界范围的灾害性害虫。烟粉虱寄主范 围广泛，在行为、危害习性和传毒能力等方面义分
化为多种生物型（ＢＩＤｗｎ以。Ｚ．，１９９５）。由于不｜ｉＪ
的生物型在危害、习性和对化学农药的抗性上有许
多差异（Ｃｏｓｔａ以Ⅱ２．，１９９３；ＢＹ丌Ｉｅ
的ｄｄＨ，Ｏ，１００屯下水浴５ ｍｉｎ。取１００吐提取液，
抗药性，如氯氰菊酯等菊酯类农药。这些置别使得 Ｂ型更易造成猖獗危害，发生后更难于控制。 １９９１年，Ｒ型烟粉虱在美国南加州和亚利桑那
州大发生，据估箅、’年烟粉虱在美国部分地区危害 所造成的损失超过了５亿美元（｝’ｅ州ｎ只“耐，
加人两倍体积的预冷无水乙醇，冰浴２
ｂｐ
虱属于Ｒ生物型；但由于缺少分子牛物学及遗传
学方面的证据，尚不能确切断定我国烟粉虱的生物 刊。烟粉虱的小同生物型在外部形态上难以区分，
ＰｃＲ反应系统体积为２０ ＪｔＬ，含１ｕ Ｔａｑ酶，反
应缓冲液，２ ５ｍｍｏｌ儿Ｍ异ｃ１２，Ｏ．２５ ｍ丌１０ｌ，Ｌ㈣ＴＰ，２ Ⅱ叫ｍＬ ＢｓＡ，５０“ｇ ｃ】一Ｊ一２１９５，５０”ｇ １２一Ｎ一３０１４，模
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１．３
ＰｃＲ反应条件 所用引物为通用引物ｃｌ—Ｊ一２１９５（５，＿ｌＴｌｌ一
１９９３）。烟粉虱在我幽很早就存在（阎风鸣，１９９１）， 但没有造成大的危害；近两ｉ年来烟粉虱开始在我 国华北地区和其他地区大发生（张芝利，２０００），
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１９９３；Ｂｍｗｎ“甜．，１９９５）：（１）Ｂ型娴粉虱在西葫 芦卜危害能引起银叶病（ｓｑｕａｓｈ ｓｉｌｖｅｄｅ“ｄ确Ｈｋｒ）． 而Ａ型却不能；（２）Ｂ型比Ａ型有更广泛的寄主植
１９９３），因此，牛物型的鉴定对于烟粉虱的预测预 报、综合防治（如药剂选择、天敌引进和筛选等）
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国家科技攻关项目；化京市口然科学蕞金瑚目（６０２２００７）；周家“９７３”项目
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作者简介：罗晨，爻，１９７０午１０月牛，博十，助理研究员，从事害虫牛物防治研究，Ｆ—１１：ｌＰｌ０Ｉｏ＠１６３
＊通讯作者Ａｕｔｈｏｒ
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收稿日期Ｒｅ嘲ｖＨｌ：２００１｜１ １２；接受日期ＡｃｃｅＤｋｄ：２００２—０７．２４
万方数据
昆虫学报＿ｃｌｏ
Ｅｒ咖ｒ删妇油ｓｉｎ沁
４５卷第６期
物，保守估计已超过５００种；（３）Ｂ型比Ａ型取食 更多的植物汁液，分泌更多的蜜露；（４）Ｂ型比Ａ 型产卵量更大；（５）Ｂ型对某几种杀虫剂有更高的
ｍＩ，的蛋白酶Ｋ，允分混匀后，置于６０℃水浴锅中
３
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图Ｌ我国崩粉虱５个种群与ｎｘ矾一Ｂ（７２０ ｈｐ）、＾ｄ∞ｒ心Ｂ（４２３ ｈｐ）序列比较图
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巾同农业人学植物保护学院，北京
１【籼３）
摘要：利用ｍｌＤＮＡ ｃＯＩ基因Ｈ段件标记，采用序列分析的方法，从分子牛念学的角度研究ｒ近年来在我国暴发危。筹的烟粉
虱口洲“眦旭＾眦ｉ ５个种群（北京一曲红种群，广州甘蓝种群，西安一品钉种群，北京西红柿种群和新疆吐旨番棉花种群）
的牛物型。在５个种群的基因片段上，截取与１■…Ｂ型相应的７２０ ｂｐ的序列分析．结果表明所测序列中Ｈ有２个碱幕与 ｎ—Ｂ型小同，序列相似性为９９ ７％；在西安一品玎种群和新疆吐昔番棉花种群的隙序列中截取与Ａｄｚｏｎａ—Ｂ型序列相应的
Ａ，８９（：，１３９（；，３１０ Ｔ，Ａ＋Ｔ
的含量为６８．３％．这条序列编码２４０个氨基酸，是
细胞色素氧化酶第一业荩一０Ｈ端的 码的氨基酸序列分别见图２。
部分。北京
品红ｒ的烟粉虱种群ｃ０ Ｉ基园部分序列及其编
粉虱已知的ｃＯ Ｔ序列（美国ｎｘａ讣Ｂ型，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｌ∽Ｎｏ：ＡＦｌ６４６７５）作比较，分别从每个片段中
表ｌ烟粉虱样品的来源
Ｔａｂｋ ｌ ＳＯＩＩｒｃｅ
若扩增出单一的目标片段，用Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ纯化系 统直接进行纯化。若除了日标片段外还有杂带，则 先用低熔点琼脂糖分离后再用Ｐｒｏｍ喂ａ ＤＮＡ纯化系 统回收ＤＮＡ片段。
１．６序列测定与分析 纯化后的样品送至上海博砸生物技术有限公司
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采集地 ｋ蚰ｔｉｌ，ｒｌ 北京№ｕ１“ｇ
采集时间
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编号
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奇主
ห้องสมุดไป่ตู้
测序，测序所Ｈｊ为ＡＢＩ一３７７测序仪及配套的Ｂｉ蛐ｖｅ Ｔｅｎ面ｎａｔｏｒ试剂盒。每个样品的测序分别从序列的 ２１９５引物端和３０１４引物端进行。得到的测序结果
用ｃＬｕｓＴＡ ＴＪ（１＿８）进行排序分析，比较所得序列
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烟粉虱执ｍｉ缸￡ｎ６∞ｉ（Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）是热带和哑 热带地区主要害虫之・，南美洲、欧洲、非洲、亚 洲、大洋洲的很多国家和地区都有分布（Ｍｏｕｎｄ
４２３ｌＪｐ片段，分析表明这两个种群与ＡｚＲ３型属于ｌ司一个单倍型。因此，我国烟粉虱５个实验种群的牛物型与７ｌ踟ｓ—Ｂ犁和
Ａｊ跏一Ｂ型种群为同一牛物型“Ｂ”。
中图分类号：Ｑ９６５
关键词：烟粉虱；ｌ，ｃＲ；ｍＩＤＮＡ；ｃ０Ｉ基因序列；生物型 文献标识码：＾ 文章编号：０４５４—６２９６（２００２）０６一０７５９一０５
困而，分子系统学的技术就成为鉴定烟粉虱不同生 物型的有效手段。本项研究试图利用ｍｌＤＮＡ
ｃ０
板ＤＮＡ为２”ｌ帕反应体系于９４℃预变性５嘶ｎ后， 进行３５个如Ｆ循环：９４℃变性ｌ ｒＩｌｉｎ；５０℃退火ｌ ｍｉｎ；７２℃延伸ｌ｜Ｉｌｉｎ。循环结束后７２℃延伸５
反应产物置于４℃冰箱保存。
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截取７２０ ｂｐ的序列进行分析（图１）。可以看出，５ 条７２０ ｈ【Ｉ的序列在所有的位点上都是埠Ｅ的。各个 碱基的含量为：１８２
作比较，从而为鉴定在我国暴发危害的烟粉虱生物
型和确定其来源提供分子生物学的证据。
１．４琼脂糖凝胶电泳 ＰＣＲ产物以１ ６％琼脂糖凝胶电泳分离，ＥＢ染 色后在紫外透视仪Ｅ观察，记录结果。
１．５
ｌ材料与方法
Ｉ．１材料
ＰｃＲ产物回收纯化 在电泳巾检测到目标片段后，进行产物纯化。
５个地理区域或寄主植物上的烟粉虱种群，经 室内镜检ｌｏ头以ｒ ４龄若虫（伪蛹）的形态特征， 确定为烟粉虱后．再进一步做分子乍物学试验。其 编号、寄士、采集地、采集时间见表ｌ。
的离心管底部将粉虱充分研磨匀浆，将匀浆液吸入 ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。向管中加入１止２０哗，
万方数据
本实验方法重复性好，水浴２ ｈ提取的烟粉虱单个
个体的ＤＮＡ足以进行ＰｃＲ反应，其产物大小在 ８３ｌｌⅢ和９４１ｂｐ之间，与预计中的产物大小相近。
可以初步判定该产物是所需的日的片段。 ２．２测序结果分析
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西安ｘ】’肼２ｍ】ｌ 北京雎Ｕ－碍２００１
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之问的差异，并与ＧｅｎＢａｎｋ中烟粉虱ｃＯ Ｉ部分序
列进行比较。
２３
新疆吐督番～ｌｌ劬，ｘ１
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ＤＮＡ提取 取粉虱个体Ｉ头，置于滴有２０扎碱裂解液
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ｌＯ呻８９：２北京大学生命科学学院，北京
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其镜检特征和危害西葫芦造成的银叶症状与国外报 道的Ｂ型烟粉虱相似，怀疑我国最近发生的烟粉
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（５’一Ｔ（：ｃＡＡＴＧｃＡｃＴＡＡＴｃＴＧＣＣＡＴＡＴＴＡ。３’）。扩增产
物是ｃ０Ｉ基因３ ７末端的部分序列，大小为８４０ 左右（ｓｉ眦ｍ雠缸．，１９９４）。
０），２０
２结果与分析
ｍｒｎｏｌ，Ｌ Ｎａｃｌ， ｌ ２．１
（５０ ｎ¨¨０１儿｜ｒｄｓ—Ｈｃｌ（ｐＨ ８
ＰＣＲ产物检测
ｍ啪ｕＬ ＥＤＴＡ，１％ｓＤｓ）的封口膜卜二，用０
Ｉ ５
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为保证实验的可重复性，在提取ＤＮＡ时，对 北京西红柿种群的个体进行了水浴不同时间的效果 试验，并对ＰＣＲ产物进行电泳检测。结果证明．
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有非常重要的意义。
目前在全世界危害最严重的是Ｂ型烟粉虱。 ＢｅＩｌｏｗｓ等（１９９４）在形态Ｐ对Ｂ型烟粉虱和Ａ型 烟粉虱进行了描述：Ｂ型烟粉虱蛹壳上多数无第Ｐｑ 根亚前缘毛，其尾气管孔Ｌ３的蜡缘饰宽度一般不超 出尾刚毛；而Ａ型烟粉虱则相反。尽管Ｂ型很难 通过形态确认，但它在生物学特征ｒ和原来泛指的 烟粉虱（Ａ型）存在着明显的差异（Ｐｅ而ｎｇ
ｅ￡卅，
Ｈａｌｓｅｖ，１９７８）。近年来，烟粉虱大范围扩散，
已成为一种世界范围的灾害性害虫。烟粉虱寄主范 围广泛，在行为、危害习性和传毒能力等方面义分
化为多种生物型（ＢＩＤｗｎ以。Ｚ．，１９９５）。由于不｜ｉＪ
的生物型在危害、习性和对化学农药的抗性上有许
多差异（Ｃｏｓｔａ以Ⅱ２．，１９９３；ＢＹ丌Ｉｅ
的ｄｄＨ，Ｏ，１００屯下水浴５ ｍｉｎ。取１００吐提取液，
抗药性，如氯氰菊酯等菊酯类农药。这些置别使得 Ｂ型更易造成猖獗危害，发生后更难于控制。 １９９１年，Ｒ型烟粉虱在美国南加州和亚利桑那
州大发生，据估箅、’年烟粉虱在美国部分地区危害 所造成的损失超过了５亿美元（｝’ｅ州ｎ只“耐，
加人两倍体积的预冷无水乙醇，冰浴２
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虱属于Ｒ生物型；但由于缺少分子牛物学及遗传
学方面的证据，尚不能确切断定我国烟粉虱的生物 刊。烟粉虱的小同生物型在外部形态上难以区分，
ＰｃＲ反应系统体积为２０ ＪｔＬ，含１ｕ Ｔａｑ酶，反
应缓冲液，２ ５ｍｍｏｌ儿Ｍ异ｃ１２，Ｏ．２５ ｍ丌１０ｌ，Ｌ㈣ＴＰ，２ Ⅱ叫ｍＬ ＢｓＡ，５０“ｇ ｃ】一Ｊ一２１９５，５０”ｇ １２一Ｎ一３０１４，模
ｈ。以１２０００
ｒ，ｍｉｎ离心２０ ＩＩｌｉｎ，ＤＮＡ沉淀章温晾干。每管加入 ２０“Ｌ缓冲液（ｐＨ ８．０），溶解后即可用丁ＰｃＲ反 应。
１．３
ＰｃＲ反应条件 所用引物为通用引物ｃｌ—Ｊ一２１９５（５，＿ｌＴｌｌ一
１９９３）。烟粉虱在我幽很早就存在（阎风鸣，１９９１）， 但没有造成大的危害；近两ｉ年来烟粉虱开始在我 国华北地区和其他地区大发生（张芝利，２０００），
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１９９３；Ｂｍｗｎ“甜．，１９９５）：（１）Ｂ型娴粉虱在西葫 芦卜危害能引起银叶病（ｓｑｕａｓｈ ｓｉｌｖｅｄｅ“ｄ确Ｈｋｒ）． 而Ａ型却不能；（２）Ｂ型比Ａ型有更广泛的寄主植
１９９３），因此，牛物型的鉴定对于烟粉虱的预测预 报、综合防治（如药剂选择、天敌引进和筛选等）
基金项甘
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国家科技攻关项目；化京市口然科学蕞金瑚目（６０２２００７）；周家“９７３”项目
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作者简介：罗晨，爻，１９７０午１０月牛，博十，助理研究员，从事害虫牛物防治研究，Ｆ—１１：ｌＰｌ０Ｉｏ＠１６３
＊通讯作者Ａｕｔｈｏｒ
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收稿日期Ｒｅ嘲ｖＨｌ：２００１｜１ １２；接受日期ＡｃｃｅＤｋｄ：２００２—０７．２４
万方数据
昆虫学报＿ｃｌｏ
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４５卷第６期
物，保守估计已超过５００种；（３）Ｂ型比Ａ型取食 更多的植物汁液，分泌更多的蜜露；（４）Ｂ型比Ａ 型产卵量更大；（５）Ｂ型对某几种杀虫剂有更高的
ｍＩ，的蛋白酶Ｋ，允分混匀后，置于６０℃水浴锅中
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图Ｌ我国崩粉虱５个种群与ｎｘ矾一Ｂ（７２０ ｈｐ）、＾ｄ∞ｒ心Ｂ（４２３ ｈｐ）序列比较图
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巾同农业人学植物保护学院，北京
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摘要：利用ｍｌＤＮＡ ｃＯＩ基因Ｈ段件标记，采用序列分析的方法，从分子牛念学的角度研究ｒ近年来在我国暴发危。筹的烟粉
虱口洲“眦旭＾眦ｉ ５个种群（北京一曲红种群，广州甘蓝种群，西安一品钉种群，北京西红柿种群和新疆吐旨番棉花种群）
的牛物型。在５个种群的基因片段上，截取与１■…Ｂ型相应的７２０ ｂｐ的序列分析．结果表明所测序列中Ｈ有２个碱幕与 ｎ—Ｂ型小同，序列相似性为９９ ７％；在西安一品玎种群和新疆吐昔番棉花种群的隙序列中截取与Ａｄｚｏｎａ—Ｂ型序列相应的
Ａ，８９（：，１３９（；，３１０ Ｔ，Ａ＋Ｔ
的含量为６８．３％．这条序列编码２４０个氨基酸，是
细胞色素氧化酶第一业荩一０Ｈ端的 码的氨基酸序列分别见图２。
部分。北京
品红ｒ的烟粉虱种群ｃ０ Ｉ基园部分序列及其编
粉虱已知的ｃＯ Ｔ序列（美国ｎｘａ讣Ｂ型，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｌ∽Ｎｏ：ＡＦｌ６４６７５）作比较，分别从每个片段中
表ｌ烟粉虱样品的来源
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若扩增出单一的目标片段，用Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ纯化系 统直接进行纯化。若除了日标片段外还有杂带，则 先用低熔点琼脂糖分离后再用Ｐｒｏｍ喂ａ ＤＮＡ纯化系 统回收ＤＮＡ片段。
１．６序列测定与分析 纯化后的样品送至上海博砸生物技术有限公司
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采集地 ｋ蚰ｔｉｌ，ｒｌ 北京№ｕ１“ｇ
采集时间
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编号
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测序，测序所Ｈｊ为ＡＢＩ一３７７测序仪及配套的Ｂｉ蛐ｖｅ Ｔｅｎ面ｎａｔｏｒ试剂盒。每个样品的测序分别从序列的 ２１９５引物端和３０１４引物端进行。得到的测序结果
用ｃＬｕｓＴＡ ＴＪ（１＿８）进行排序分析，比较所得序列
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烟粉虱执ｍｉ缸￡ｎ６∞ｉ（Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）是热带和哑 热带地区主要害虫之・，南美洲、欧洲、非洲、亚 洲、大洋洲的很多国家和地区都有分布（Ｍｏｕｎｄ
４２３ｌＪｐ片段，分析表明这两个种群与ＡｚＲ３型属于ｌ司一个单倍型。因此，我国烟粉虱５个实验种群的牛物型与７ｌ踟ｓ—Ｂ犁和
Ａｊ跏一Ｂ型种群为同一牛物型“Ｂ”。
中图分类号：Ｑ９６５
关键词：烟粉虱；ｌ，ｃＲ；ｍＩＤＮＡ；ｃ０Ｉ基因序列；生物型 文献标识码：＾ 文章编号：０４５４—６２９６（２００２）０６一０７５９一０５
困而，分子系统学的技术就成为鉴定烟粉虱不同生 物型的有效手段。本项研究试图利用ｍｌＤＮＡ
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板ＤＮＡ为２”ｌ帕反应体系于９４℃预变性５嘶ｎ后， 进行３５个如Ｆ循环：９４℃变性ｌ ｒＩｌｉｎ；５０℃退火ｌ ｍｉｎ；７２℃延伸ｌ｜Ｉｌｉｎ。循环结束后７２℃延伸５
反应产物置于４℃冰箱保存。
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基因片段作标记，将所得序列与（；ｅｎＢａｎｋ已有序列
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