细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法

细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检

测方法

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林

【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性

细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。

1 单个细胞水平测定CTL活性

目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血

单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。

1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。

1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平, 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平, 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。当然, ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量, 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量, 而且, 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中, 随着ELISPOT技术的发展, ELISA法的应用已逐渐减少。

1.3 固相酶联斑点法( Enzyme linked immuno spot, ELISPOT) 基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅灵敏度大为提高, 而且能得到分泌细胞因子的细胞频数。CTL受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子, 就被预包被的抗体直接捕获, 通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数, 从而反映抗原特异性CTL的活性。此法的优点在于: (1)激活的T细胞周围环境中细胞因子高度浓集, 即使只分泌100个因子的细胞, 也能被检测出来, 敏感性很高; (2)使用的2种单克隆抗体一般识别同一种因子的2个不同表位, 特异性很高; (3)可对T细胞直接进行检测, 不需要体外扩增, 所需的T细胞量较少, 应用冻存的PBMC可以反复检测多种细胞因子; (4)在检测细胞数量的同时也可反映其功能, 与临床结果相关性较好。但是ELISPOT法也有一些缺点: 检测到的T细胞必须能分泌目标细胞因子, 如果T细胞无功能或分泌其他的细胞因子, 就有可能低估抗原特异性细胞的数量; 除了CTL, 一些辅助T淋巴细胞(CD3+和CD4+)、自然杀伤细胞等也可分泌相同的细胞因子, 故还需结合细胞表型的分析, 为解决这一问题, 目前已经有同时检测两种细胞因子的方法［4］。

Malyguine等［5］比较了分别对GrB(颗粒酶B) ELISPOT法、IFNγ ELISPOT法和51Cr释放法进行了比较, 实验结果显示三者的相关性较好, 并指出检测GrB ELISPOT法与51Cr释放法的反应性非常接近, 而比IFNγ ELISPOT法和四聚体法更快速更直接。

ELISPOT法所需细胞少, 鉴定抗原表位效率很高。另外基于IFNγ或TNFγ分泌性CD8+T细胞的ELISPOT法已用于检测几种MHCⅠ类分子限制性黑色素瘤抗原, 如MAGE、gp100、Mart1、酪氨酸酶等［6］。缺点是大数量的斑点, 或者斑点的形状变异较大而导致人工分析变得很困难。如果应用计算机辅助成像检测技术即可解决此问题, 还能够确定分析斑点的面积, 分析T淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。

1.4 染色细胞内的细胞因子体外培养、刺激、活化细胞, 用Brefeldin A封闭细胞因子分泌途径, 使细胞因子在细胞内累积。然后, 用荧光或生物素标记的CD4+或CD8+的mAb对细胞进行CD4或CD8表面标志物染色, 再经去污剂固定并增高细胞通透性, 使抗细胞因子荧光抗体结合到细胞内［7］。最近已经建立了CD4+T细胞和CD8+T 细胞的抗原特异性细胞因子分泌细胞的细胞内染色方法。此方法应用细胞内累积细胞因子的染色和多种颜色参数的FACS法, 是检测人循环淋巴细胞中抗原特异性T淋巴细胞的可行方法。

1.5 基因水平的检测通过PCR、RT PCR或荧光定量PCR可以对细胞因子的DNA或RNA进行检测, 这是检测一种或多种目标基因转录水平的较为准确的分子生物学方法。Kruse等［8］曾用荧光定量RT PCR 法分析了冷冻保存的正常人血标本中的细胞因子mRNA 水平, 许多肿瘤免疫的临床试验中, 也都应用了该法作为检测免疫反应的指标。定量RT PCR可确定抗原特异性T细胞的数目, 而且不需要任何体外刺激步骤, 是目前最敏感的细胞因子检测技术。