受体研究方法剖析

免疫组织化学(immunohistochemistry)
• 免疫组织化学（免疫细胞化学）是组织化学的
一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原（受
体）能特异性结合的特点，通过化学反应使标
记于结合后的特异性抗体上的Hale Waihona Puke Baidu示剂，如酶、
金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借
助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体
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四、受体研究的意义
* 受体是调节细胞功能的有高度特异性
的“门户”，而细胞功能的改变是乃 许多疾病的基础，因此研究受体结构 功能的改变和各种重要疾病发病机制 的关系受到高度重视；
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* 寻找有高度选择性的药物一直是科学 家的追求目标，受体的激动剂、拮抗 剂以及调节受体结构和功能的药物正 是这方面极有前途的研究对象。
图18 体外培养的平滑肌细胞 （免疫组织化学染色显示肌动蛋白）
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。
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贴壁细胞：待细胞长到90%左右去掉培养 基，换为配基结合反应的缓冲液，不作 成悬液，直接向贴壁细胞中加入放射性 配基进行结合反应。 反应结束后，用冰冷的缓冲液洗去多余 的游离配基，然后收集细胞，测定放射 性。
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3 亚细胞组分的差速离心法分离 全过程在4°C下进行。 组织匀浆—上清液– 上清液– 上清液（核受体）
•
免疫细胞化学的突出优点是：
1. 高度的特异性
抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免
疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或
单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上 可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方 法难以相比的。
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2. 高度敏感性
现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度
保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增 敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证 可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子 显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或 基因水平的检测技术。
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* 从更深层次上看，受体和配给的 结合属于研究蛋白质三维结构的 重要内容，在分子生物学已进入 后基因组时代的今天，这方面的 研究有很重要的理论意义。
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第一节 受体的放射配基结合分析
第一节
基本原理
◆20世纪20年代末A.J.Clark发现药物效应 与受体结合量呈正比且药物活性与受体 亲和性有关。
（800-3500g，~15分钟）---（10000-30000g，20min）--（100000g，60min）
注意问题： ●除去内源性配基和蛋白水解酶 ●受体标本保存，-70°C保存 ●受体蛋白从从膜结构或核中溶脱成可 溶性受体，洗涤或用溶脱buffer。
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第二节 组织化学（histochemistry） 技术
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受体放射配基结合分析法
一、放射性配基的制备 *对放射性配基的要求 ： 放射比活度高 亲和力高 特异性高 稳定性好
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125I标记放射性配基的制备（可查相关文献）
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氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 Iodogen法，商品名为氯甘脲 乳过氧化物酶法 偶联标记法，标记游离氨基
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受体标本的制备 1 组织切片 新鲜组织冰冻切片--离体放射配基结合反 应—常规超薄切片—电镜自显影 2 完整活细胞 悬浮细胞：加入放射性配基进行结合反 应，反应结束后取少量细胞，测量放射 性。
无法测定受体－配基反应的亲和性
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免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水 平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达 到和代替的，它能在细胞、基因和分子水平同时原 位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统， 为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断， 开拓了广阔的前景。
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免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发 展，尤其是和分子生物学的理论和技术日益结合密 切，基因探针、核酸分子杂交技术、原位PCR技术、 核酸杂交和免疫细胞化学双标记技术、电镜杂交技 术等成为免疫细胞化学技术的新发展成员，标志着 免疫细胞化学又进入了一个新的发展阶段。
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核酸分子探针- 杂交-免疫细胞化学放大和显示杂交信 号，可以称为杂交免疫细胞化学。所以，核酸分子探针的
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◆提出占领理论：受体与配基以单分子相互 作用（分子比1：1），结核反应是可逆的， 亲和性相同，配基在结合和解离后不被代 谢，也不与其它类型受体结合，受体与配 基结合产生的生物效应的强度与受体被占 领的量成正比，受体结合反应平衡后服从 质量作用定律。
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◆20世纪60年代初建立受体放射配基结合分 析（Radioligand Binding Assay of Receptors, RBA） 方法
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3. 高分辨能力 免疫组织（细胞）化学经呈色反应，形成有色沉淀或 荧光，可检测出细胞和组织内超微量抗原成分 4. 方法步骤统一 若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。 5. 形态、机能和代谢密切结合 是一种综定性、定位和定量密切结合；形态、机能 和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
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缺点：
结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化 学性质。
抗原
抗体
荧光素
辣根过氧化物酶
胶体金 图10 免疫组织化学原理模式图
图11 免疫组织化学（荧光素标记） 毛细血管内皮细胞呈vWF阳性
图12 免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记） 胰岛B细胞呈胰岛素阳性
图13
免疫组织化学电镜图示上皮细胞膜MAM－6蛋白 （A 胶体金标记 B 辣根过氧化物酶标记）
受体概论之
受体研究方法
二、受体研究的内容
* 受体与配基的相互作用； * 受体的激活机制； * 后 续信号转导的启动机制； * 信号转导的路径； * 引起相应的生物学效应。
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三、受体与配基结合反应的基本特征
*可饱和性 细胞特定的受体，数量有限。 *可逆性 内 解离；外 可逆和不可逆 *特异性和亲和力 配基、组织或器官特异 *和生物学效应相关