热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用

热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用

葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase,GDH,EC1.1.1.47)属于短链脱氢酶/还原酶(Short-chain dehydrogenases/reductase,SDRs)。它具有四个相同亚基(28.2×4kDa),能够催化D-葡萄糖为D-葡萄糖酸内酯,同时还原NAD(P)+为NAD(P)H。

近些年,GDH的研究取得了一定进展,已经应用到很多领域,例如辅酶再生、临床检测和生物燃料电池等。早期的GDH来源主要是动物新鲜肝脏,目前大部分由微生物发酵而来。

国内的GDH产量还不高,主要依靠进口。本文研究的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megtaterium IWG3)的一个突变体GDH-DN46[1],其通过定向进化和96孔板法获得,提高了酶的热稳定性和耐碱性,不管NaCl的存在与否都不会对这种突变酶的催化活性产生影响。

这种氧化还原酶在催化反应中需要依赖辅酶NAD(P)+,但辅酶价格昂贵并且稳定性差,这大大限制了氧化还原酶在工业催化方面的应用[2]。本文以GDH的突变体GDH-DN46作为研究对象,通过构建重组质粒并在大肠杆菌中成功表达,优化表达条件提高酶的活性,研究该酶酶学性质。

将其用于辅酶再生系统,用以催化合成L-叔亮氨酸。同时本论文建立了可利用仿生辅酶的GDH的高通量筛选平台,探索仿生辅酶替代NAD(P)+在工业催化方面的应用。

论文的主要研究内容如下:1.构建了在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达GDH的重组表达质粒pET28a-GDH,E.coliBL21(pET28a-GDH)的酶活可达到 0.95 U/mg。对重组菌的培养和诱导条件进行优化,优化后的酶活提高到1.52 U/mg,比

初始酶活提高了 60%。

2.对GDH的酶学性质进行研究,通过研究温度对其酶活性的影响,该酶最适温度为50℃,其酶活比在30℃测量条件下的酶活提高了 30%,最适pH是7.0,具有很高的耐碱性。

3.分别构建葡萄糖脱氢酶(GDH)和亮氨酸脱氢酶(LeuDH)表达质粒pET28a-GDH和pET20b-LeuDH,并将其转化到大肠杆菌E.Coli BL21中,获得双质粒表达系统E.Coli BL21(pET28a-GDH/pET20b-LeuDH)。

与用亮氨酸脱氢酶全细胞催化三甲基丙酮酸(TMP)生产L-叔亮氨酸的转化

率相比,双质粒表达系统全细胞催化合成的转化率提高了约三倍。4.研究了通过定向进化筛选可利用仿生辅酶的GDH方法,建立了可利用仿生辅酶高通量筛选平台,通过研究不同染料对辅酶NADH的颜色反应,确定高通量筛选染料为氮蓝四唑(NBT)。

得到优化的筛选平台配方是:Tryptone 1%;Yeast extract 0.5%;NaCl 1%;Agar 1.8%;NBT O.1mg/mL;PMS 0.01 mM;Kan 0.05 mM;IPTG 0.1 mM;Glucose 1 mM;NMN+ 0.05 mM。通过对重组菌 700C 热处理1小时,可以使胞内辅酶NADH分解,通过热处理可以有效避免显色筛选过程中胞内的辅酶NADH产生的背景干扰。